苦蘵育種F1群體真?zhèn)舞b定△

劉玉洋，何金宇，劉朋麗，馮尚國，王慧中，盧江杰

(杭州師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院/浙江省藥用植物種質(zhì)改良與質(zhì)量控制技術(shù)重點實驗室，浙江 杭州 310018)

苦蘵PhysalisangulataL.為茄科酸漿屬草本植物，又稱為苦蘵草、天泡草、炮仔草等，在秦漢時期的《爾雅》中已有記載，其果、根和或全草皆可入藥，是傳統(tǒng)中藥材?？嗵u長有短毛或無毛，莖多分枝，葉片呈橢圓形，果實為球形，包于宿萼中，種子為圓盤狀，花、果期為5～12個月[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，苦蘵中含有多種化學(xué)成分，主要有甾體類、甾醇類、有機酸、多糖等[2-4]，可用于治療天皰瘡、疔瘡、痢疾、感冒、咳嗽等疾病[5]，有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗菌等藥理活性[6-9]，具有很高的藥用價值和經(jīng)濟價值?？嗵u有效成分含量因地域不同而有一定差異，因此，培育高活性成分的苦蘵新品種，尤其是挖掘現(xiàn)有野生苦蘵種質(zhì)資源中有效成分含量遺傳基礎(chǔ)成為育種工作者以及科研人員的重要課題。

高密度遺傳圖譜是QTL定位研究的重要依據(jù)，可為分子標記輔助選擇育種提供工具，而分離群體的構(gòu)建是繪制高密度遺傳連鎖圖譜的關(guān)鍵因素，分離群體質(zhì)量的好壞也直接決定了遺傳圖譜構(gòu)建的難易程度。若分離群體中真雜交種數(shù)所占的比例越高，則表明該群體質(zhì)量越高。因此，快速、準確鑒定出真雜種是評估分離群體質(zhì)量的重要方法。鑒定分離群體真雜交種的方法主要有形態(tài)觀察法、同工酶鑒定法、細胞學(xué)鑒定法和分子標記鑒定法等[10]，與其他三種鑒定方法相比，分子標記鑒定法更加準確，可以有效的減少人為因素的影響，并且操作簡單、方便快捷。SSR分子標記具有共顯性強、多態(tài)性豐富、穩(wěn)定性高、分布廣泛、數(shù)量多、重復(fù)性好、模板DNA質(zhì)量要求不高等特點[11-15]，已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物雜交后代真?zhèn)蔚目焖勹b定。張敏等[16]利用SSR對鄂茄子2號雜種一代群體進行純度鑒定，在140份樣品中有4份為雜合子，剩余136株均為純合子，占總數(shù)的97%。陸鑫等[17]構(gòu)建了甘蔗熱帶種“路打士”與滇蔗茅“云南95-19”的雜交F1代群體，利用4對SSR引物進行62份雜交后代的鑒定，發(fā)現(xiàn)雜交真實率高達100%。張寧潔[18]從120對SSR引物中篩選出2對引物用于甘藍型油菜雜交種純度的分子標記鑒定，發(fā)現(xiàn)油菜雜交群體F1代的純度在90%以上。

目前對藥用植物苦蘵的研究大多集中在有效成分[19]、遺傳多樣性[20]方面，雜交群體的構(gòu)建和雜交后代真?zhèn)舞b定等研究未見報道。本研究利用SSR分子標記技術(shù)對苦蘵雜交群體進行雜種鑒定，為苦蘵高密度遺傳圖譜的構(gòu)建和有效成分的QTL定位等相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

實驗材料由浙江省藥用植物種質(zhì)改良與質(zhì)量控制技術(shù)重點實驗室提供，利用苦蘵臨海種源(♀)和浦江種源(♂)構(gòu)建苦蘵雜交群體F1代，對85個雜交F1后代進行雜交種真?zhèn)蔚姆肿予b定。選取新鮮苦蘵葉片，置于-80 ℃冰箱保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 苦蘵基因組DNA的提取 使用本實驗室改良的CTAB法提取苦蘵基因組DNA[21]，與其他方法相比，該方法做了以下改良：將苦蘵葉片充分研磨后，取適量粉末于離心管中，迅速加入適量CTAB-free溶液，離心后除去上清液，本步操作可有效除去葉片中多糖等雜質(zhì)，確保提取的苦蘵基因組DNA純度高。

利用紫外分光光度計檢測苦蘵基因組DNA濃度以及OD260/280比值，利用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)檢驗有無蛋白質(zhì)、RNA等雜質(zhì)的污染以及是否降解。待檢測合格后，將苦蘵基因組DNA母液稀釋至50 ng·μL-1，置于-20 ℃冰箱保存，用于后續(xù)PCR擴增實驗。

1.2.2 苦蘵SSR引物的初步篩選 本實驗所用引物是基于苦蘵轉(zhuǎn)錄組測序所得序列設(shè)計的SSR引物，由上海生工生物公司合成，共計200對SSR引物。以臨海、浦江雙親本和兩個雜交后代單株18號和45號的DNA為模板，從200對引物中初步篩選出條帶清晰、重復(fù)性好、多態(tài)性豐富的真實SSR引物，用于后續(xù)實驗。

1.2.3 PCR擴增反應(yīng) PCR反應(yīng)體系(20 μL)：10×PCR Buffer(含Mg2+)2 μL，dNTPs(10 mmol·L-1)0.6 μL，Primer F(10 μmol·L-1)1 μL，Primer R(10 μmol·L-1)1 μL，Taq酶(2U·L-1)1 μL，苦蘵基因組DNA(50 ng·μL-1)1 μL，ddH2O 13.4 μL。

PCR反應(yīng)程序如下：94 ℃預(yù)變性3 min，30個循環(huán)(94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸90 s)，72 ℃延伸10 min后，4 ℃保存。

1.2.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測 ①凝膠制備：用量筒分別量取6%丙烯酰胺80 mL，10%過硫酸銨800 μL，TEMED 50 μL，在燒杯中充分搖勻后，緩慢倒入兩玻璃板間，確認無氣泡后，插上梳子，水平放置半小時至膠凝固。②電泳：向擴增產(chǎn)物中加入2 μL loading buffer，低速離心均勻后，取3 μL混合液點樣。連接電源，200 V恒壓電泳1小時。③銀染：電泳結(jié)束后，從玻璃板中取出凝膠，用蒸餾水漂洗三次，除去凝膠上的緩沖液。用0.1%的AgNO3溶液銀染10 min，在蒸餾水中漂洗三次，除去凝膠上殘留的AgNO3溶液。將凝膠置于顯影液中直至顯示出明顯條帶后，蒸餾水漂洗三次，除去顯影液。取出凝膠置于顯影板上拍照，用保鮮膜包好，4 ℃保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦蘵SSR引物的初步篩選

我們選擇臨海、浦江雙親本和兩個雜交后代單株18號和45號的DNA為模板，用于苦蘵SSR引物的初步篩選。經(jīng)過聚合酶鏈式反應(yīng)擴增目的片段，聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，銀染，拍照，得到苦蘵SSR引物初步篩選的電泳圖，圖1為部分電泳圖。

在苦蘵SSR引物初步篩選電泳圖中，我們挑選出有清晰條帶且在苦蘵雙親間有明顯差異的引物(紅框標注)用于后續(xù)苦蘵雜交群體的真雜交種鑒定研究，最后我們從200對苦蘵SSR引物中初步篩選出56對用于后續(xù)分析。

注：圖中M為DNA標準分子量；數(shù)字編碼為所用SSR引物編號；每個方框中為雙親和兩個雜交后代。圖1 苦蘵SSR引物初步篩選的電泳圖

2.2 苦蘵雜交群體的鑒定

我們將初步篩選出的56對SSR引物用于苦蘵雜交群體的真?zhèn)舞b定研究，經(jīng)聚合酶鏈式反應(yīng)擴增、聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測、銀染、拍照后，得到兩對SSR引物可用于苦蘵雜交群體F1代真雜交種的鑒定。兩對苦蘵SSR引物詳細信息如表1所示。

表1 篩選出的2對SSR引物信息

根據(jù)苦蘵PCR產(chǎn)物的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖，我們將F1代單株的帶型分為三種，分別是雙親互補型、母本型和缺失型[22]，如圖2所示。雙親互補型是指子代中至少含有一條母本和父本的特征帶；母本型是指子代的帶型與母本帶型相同；缺失型是指子代帶型與雙親帶型均不相同，缺少一條或一條以上特征帶。在真雜交種鑒定過程中，雙親互補型的單株為真雜交種，母本型和缺失型的單株需要用其他SSR引物進一步鑒定。

圖2 苦蘵SSR引物電泳帶型圖

如圖3所示，利用引物SSR0959對85個苦蘵雜交群體F1代進行鑒定，在160～200 bp之間，母本臨海種源共有2條帶且皆為特異性條帶，父本浦江種源共有3條帶且皆為特異性條帶，其中雙親互補型的單株有15個，母本型的單株有70個。因此，SSR0959號引物可以從85個F1代群體中鑒定出15個真雜交種，真雜交種數(shù)占苦蘵雜交群體總數(shù)的18%。

如圖4所示，利用引物SSR0116對85個苦蘵雜交群體F1代進行鑒定，在150～250 bp之間，母本臨海種源共有7條帶，其中特異性條帶有4條，父本浦江種源共有6條帶，其中特異性條帶有4條，在雜交群體F1代中，除編號30的單株為缺失型以外，其余單株均為雙親互補型。因此，利用SSR0116號引物可以從85個F1代群體中鑒定出84個真雜交種，真雜交種數(shù)占苦蘵雜交群體總數(shù)的99%。

注：M為DNA標準分子量；1～85為雜交后代單株編號。圖3 引物SSR0959對雜交F1群體后代的擴增電泳圖

注：M為DNA標準分子量；1～85為雜交后代單株編號。圖4 引物SSR0116對雜交F1群體后代的擴增電泳圖

利用一對SSR引物鑒定雜交群體的真雜交種，有一定的局限性，無法準確的從雜交群體種鑒定出所有的真雜交種，為確保將雜交群體中所有的真雜交種都鑒定出來，需要用多對引物同時進行鑒定。本研究利用了兩對SSR引物對苦蘵的雜交群體F1代進行鑒定，用引物SSR0116鑒定時，只有30號單株的帶型為缺失型，而當(dāng)用引物SSR0959鑒定時，30號單株的帶型為雙親互補型即真雜交種。綜上所述，利用引物SSR0116和SSR0959可以鑒定出85個真雜交種，真雜交種數(shù)占苦蘵雜交總數(shù)的100%，因此，本實驗中苦蘵雜交群體F1代單株均為真雜交種。

3 討論

本研究利用SSR分子標記技術(shù)對苦蘵雜交群體F1代的真雜交種進行鑒定，為評估苦蘵雜交F1代群體的質(zhì)量提供依據(jù)，為苦蘵高密度遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建以及與重要數(shù)量性狀相關(guān)的QTL定位研究奠定基礎(chǔ)。從200對SSR引物中篩選出2對特異性好、穩(wěn)定性高的引物用于苦蘵真雜交種的鑒定，并且從苦蘵雜交群體F1代中鑒定出85個真雜交種，占雜交群體總數(shù)的100%。本研究結(jié)果表明，SSR分子標記技術(shù)可以用于苦蘵雜交群體真雜交種的快速、準確鑒定。