波長切換HPLC同時測定車前草中5個活性成分的含量△

柴瑞平，路娟，王曉靜，2，趙穎，呂欣鍇，陳曦，3*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟南 250355；3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所 云南分所，云南 景洪 666100)

車前草為車前科植物車前PlantagoasiaticaL.和平車前PlantagodepressaWilld.的干燥全草，具有清熱、利尿、通淋、祛痰、涼血解毒的功效，常用于治療熱淋澀痛、水腫尿少、暑濕泄瀉、痰熱咳嗽、臃腫瘡毒等疾病[1-4]。作為一味常用中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品[5]。苯乙醇苷類化合物是車前草中極具代表性的成分，目前已經(jīng)報道的車前草中苯乙醇苷類成分主要有大車前苷、毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷等[4，6-8]。黃酮類化合物[9-11]也是車前草主要有效成分之一，主要有芹菜素、木犀草素、木犀草苷等。2015版《中華人民共和國藥典》(《中國藥典》)中，以大車前苷的含量(不得少于0.1%)作為車前草的質(zhì)控標準，但是文獻報道[2，7]均證實了該標準不能全面反映不同產(chǎn)地及不同基原車前草的質(zhì)量。本研究采用多波長切換的方法對大車前苷、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、木犀草素和芹菜素5種成分在最大吸收波長下同時進行測定，以期為進一步制訂與提升車前草質(zhì)控標準提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters Acquity超高效液相色譜儀，配置四元高壓泵、自動進樣器、PDA 檢測器；Mettler AB265-S 電子分析天平(Mettler Toledo儀器有限公司)；LD-T100型中草藥粉碎機(上海頂帥電器有限公司)。

1.2 試劑與試藥

對照品大車前苷(批號：150930，純度>98%)、毛蕊花糖苷(批號：160517，純度>98%)、異毛蕊花糖苷(批號：160917，純度>98%)、木犀草素(批號：160420，純度>99%)、芹菜素(批號：160503，純度>99%)，均購自上海融禾醫(yī)藥科技有限公司。乙腈(色譜純，F(xiàn)isher)，甲酸(分析純，汕頭市西隴化工有限公司)，水(屈臣氏去離子水)。

車前草共6批次，分別產(chǎn)自陜西寶雞(1號，購于秦嶺野生中藥材批發(fā)零售網(wǎng)店)、湖北襄陽(2號，購于亳州中藥材市場)、河南信陽(3號，購于信陽正宗大別山農(nóng)村蘇仙石土特產(chǎn)店)、江西吉安(4號，購于北京同仁堂有限責任公司馬連洼藥店)、山東濰坊(5號，購于王小二的新田園網(wǎng)店)、湖北張家界(6號，購于張家界土家族野生藥材店)。經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所云南分所李海濤副研究員鑒定，1、2、6號藥材基原為車前PlantagoasiaticaL.，3、4、5號藥材基原為平車前PlantagodepressaWilld.，均為正品，符合《中國藥典》相關(guān)規(guī)定。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Waters Symmetry C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以乙腈為流動相A，0.1%甲酸-水溶液為流動相B，梯度洗脫(0～15 min，19%A；15～18 min，19%～25%A；18～22 min，25%A；22～27 min，25%～45%A；27～35 min，45%A)；流速：0.8 mL·min-1，檢測波長：330 nm(0～29 min)、350 nm(29.01～31 min)和338 nm(31.01～35 min)，柱溫：25 ℃，進樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取對照品大車前苷10.71 mg、毛蕊花糖苷10.10 mg、異毛蕊花糖苷13.14 mg、木犀草素8.56 mg、芹菜素8.64 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL，分別制成以下質(zhì)量濃度的對照品溶液：大車前苷1.071 mg·mL-1、毛蕊花糖苷1.010 mg·mL-1、異毛蕊花糖苷1.314 mg·mL-1、木犀草素0.856 mg·mL-1、芹菜素0.864 mg·mL-1。移取芹菜素對照品溶液0.5 mL，置于10 mL容量瓶中，甲醇稀釋并定容，得質(zhì)量濃度為0.043 2 mg·mL-1的芹菜素儲備液。

2.2.2 混合對照品溶液 分別精密量取各對照品儲備液適量，用甲醇定容，配制成含大車前苷428.4 μg·mL-1、毛蕊花糖苷353.6 μg·mL-1、異毛蕊花糖苷184.0 μg·mL-1、木犀草素8.56 mg·mL-1、芹菜素1.08 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液 各產(chǎn)地車前草樣品均粉碎后過二號篩，精密稱取1號樣品0.501 2 g、2號樣品1.016 2 g、3號樣品1.016 6 g、4號樣品1.020 2 g、5號樣品0.199 7 g、6號樣品1.020 0 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密移取60%甲醇25 mL加入錐形瓶中，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用60%甲醇補足減少的質(zhì)量，過濾，得供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 精密吸取2.2.2項下混合對照品溶液1.6、1.2、0.8、0.4、0.2 mL分別置于2 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，過0.22 μm濾膜，按照2.1色譜條件進樣。以對應(yīng)的對照品質(zhì)量濃度(μg·mL-1)為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)，進行線性回歸，得回歸方程和線性范圍。將最小質(zhì)量濃度混合對照品溶液逐級稀釋，以儀器信噪比S/N=3時作為最低檢測限(LOD)，S/N=10時作為最低定量限(LOQ)，結(jié)果見表1。

2.3.2 專屬性考察 按照2.1項下色譜條件，分別精密吸取混合對照品溶液、1號和5號供試品溶液各10 μL進樣分析，記錄色譜圖(見圖1)。5種被測成分分離度良好，均能達到基線分離，本方法專屬性良好。

2.3.3 精密度試驗 精密吸取2.2.2項下混合對照品溶液，按照2.1色譜條件連續(xù)進樣6次，測得大車前苷、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、木犀草素和芹菜素峰面積的RSD分別為0.78%、1.03%、0.95%、1.51%和1.62%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 取1號樣品的供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h按照2.1色譜條件進行測定，測得大車前苷、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、木犀草素和芹菜素峰面積的RSD分別為1.05%、0.82%、1.22%、1.85%、2.17%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

注：A.混合對照品；B.1號樣品；C.5號樣品；1.大車前苷；2.毛蕊花糖苷；3.異毛蕊花糖苷；4.木犀草素；5.芹菜素。圖1 混合對照品及車前草供試樣品HPLC圖

2.3.5 重復(fù)性試驗 取1號樣品粉末約0.5 g，共6份，按照2.2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件測定，計算含量。結(jié)果6份樣品中，大車前苷、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、木犀草素和芹菜素含量的RSD分別為0.96%、1.29%、1.13%、1.52%和2.35%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗 取已知含量的1號樣品粉末約0.25 g，共6份，精密稱定，每份中精密加入按照2.2.2項下配制的混合對照品溶液4 mL，按照2.2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1色譜條件測定，結(jié)果見表2、3。由表中各成分平均回收率及RSD可以看出，該方法加樣回收率符合要求。

表1 5個活性成分的回歸方程、線性范圍、定量限及檢測限測定結(jié)果

表2 車前草中大車前苷、毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷的加樣回收率試驗結(jié)果

續(xù)表2

表3 車前草中木犀草素和芹菜素的加樣回收率試驗結(jié)果

2.4 樣品含量測定

取2.2.3供試品溶液，按照2.1色譜條件進行含量測定，計算1～6號供試品中各成分的含量，結(jié)果見表4。

表4 車前草中5個活性成分含量測定結(jié)果(n=3) mg·g-1

注：-表示含量未達到檢測限

3 討論

從表4可以看出，不同產(chǎn)地的車前草樣品中各成分的含量差異較大，1號、2號、3號和6號樣品中大車前苷含量均達到了《中國藥典》中規(guī)定的含量限度，其中1號樣品中大車前苷含量最高。4號和5號樣品中未檢測到大車前苷的存在，以毛蕊花糖苷為主成分，其中5號樣品中毛蕊花糖苷含量最高。1號陜西寶雞樣品中5種成分的含量均較高，質(zhì)量最佳，這可能與土壤、采收季節(jié)、基原和環(huán)境等因素有關(guān)。因此以單一成分大車前苷作為中藥的質(zhì)控指標不足以反映其整體信息，多成分同時進行定量，可以準確地控制車前草的質(zhì)量，保證中藥質(zhì)量的穩(wěn)定性。

中藥成分復(fù)雜，在一個波長下難以體現(xiàn)所有成分的特征，故采用波長切換法。大車前苷、毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷為苯乙醇苷類化合物，苯乙醇苷類化合物在220、247、290、330 nm均有較大吸收，一般選擇樣品雜峰數(shù)目更少的330 nm作為檢測波長[4]。木犀草素最大吸收波長為350 nm[12]，芹菜素最大吸收波長選擇338 nm[13]。

本研究建立的多波長切換HPLC用于車前草藥材中大車前苷、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、木犀草素和芹菜素含量的同時測定，通過方法學(xué)考察表明該方法準確、簡單。實驗測得不同產(chǎn)地車前草藥材質(zhì)量存在較大差異，所以需要用多成分同時定量以保證藥材質(zhì)量穩(wěn)定性，該方法可以為車前草藥材的質(zhì)量控制提供參考。