川芎中1-(3′，4′-二羥基肉桂?；?環(huán)戊烷-2，3-二醇分離鑒定及含量測(cè)定△

羅鐳，邵喜英

(1.浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院，浙江 杭州 310052；2.浙江省腫瘤醫(yī)院，浙江 杭州 310022)

川芎為傘形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根莖，為臨床常用中藥，具有活血行氣、祛風(fēng)止痛之功效，主治胸痹心痛、胸肋刺痛、跌撲腫痛、月經(jīng)不調(diào)、經(jīng)閉痛經(jīng)、癮瘕腹痛、頭痛、風(fēng)濕痹痛[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，川芎具改善血管內(nèi)皮功能及冠狀動(dòng)脈血流量、降低血流阻力及血壓、抗氧自由基、抗炎、抗癌、抗血小板聚集、抗血栓形成、保護(hù)視神經(jīng)等多種藥理活性[2]。目前，研究人員對(duì)川芎中揮發(fā)油類(lèi)脂溶性成分研究較多，從中分離得到藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯、川芎三萜等許多脂溶性成分[3-5]，鮮有對(duì)川芎中水溶性化學(xué)成分研究的報(bào)道。然而近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，川芎水提液具有治療和保護(hù)腦缺血、冠心病、心絞痛等心腦血管疾病的功能。李喆等[6]發(fā)現(xiàn)川芎水提液具有抗氧化作用，能降低一氧化碳、丙二醛的含量，提高超氧化物歧化酶的活性。張晶晶等[7]研究表明，川芎水提液在體外具有較明顯的抗氧化活性，其抗氧化效果與濃度呈顯著的線性相關(guān)。

基于川芎水提液具有顯著的抗氧化活性，筆者嘗試分離鑒定川芎水提液中抗氧化活性的單體成分。筆者采用反相硅膠、凝膠等柱色譜分離方法，從川芎水提液中分得一水溶性成分1-(3′，4′-二羥基肉桂?；?環(huán)戊烷-2，3-二醇[1-(3′，4′-dihydroxycinnamoyl)cyclopentane-2，3-diol，DC]。DC化學(xué)結(jié)構(gòu)新穎，不同于以往報(bào)道的洋川芎內(nèi)酯、藁本內(nèi)酯等骨架類(lèi)型，系首次從該植物中分離得到。Wang等[8]從酸櫻桃中分離得到該化合物，并經(jīng)生物活性檢測(cè)表明該化合物具有很強(qiáng)的抗氧化活性，其抗氧化活性與合成抗氧化劑BHA、BHT的抗氧化活性相當(dāng)?；谠摶衔镲@著的抗氧化生物活性，本文報(bào)道了川芎中DC的含量測(cè)定方法，實(shí)驗(yàn)表明該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可為川芎藥材的質(zhì)量控制及新藥研發(fā)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

DPX 500型核磁共振波譜儀(德國(guó)Bruker公司)，LC-20AD型高效液相色譜儀(日本島津公司)，XPE205型分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)，Elmasonic P超聲波清洗器(德國(guó)Elma公司)。

1.2 試藥

收集了5批川芎藥材，購(gòu)自成都市荷花池中藥材市場(chǎng)，經(jīng)浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院中藥所郭增喜主任中藥師鑒定為傘形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根莖，標(biāo)本保存于浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院中藥所。

反相硅膠ODS填料(日本YMC公司)；Sephadex LH-20凝膠(瑞典Parmacia公司)。DC對(duì)照品為實(shí)驗(yàn)室自制，經(jīng)1H-NMR、13C-NMR確證結(jié)構(gòu)，經(jīng)HPLC歸一化法測(cè)定其純度>98%，滿足定量要求。三氟乙酸、甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 DC的提取、分離和結(jié)構(gòu)鑒定

2.1.1 提取與分離 川芎藥材10 kg，用70%乙醇水回流提取(3×2 h)，減壓回收溶劑至無(wú)醇味，加適量水分散，攪拌，靜止，除去沉淀。所得水溶性部位經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂柱色譜分離，以水-乙醇梯度洗脫，共得到4個(gè)部分，分別為Fr.1(水)、Fr.2(30%乙醇)、Fr.3(70%乙醇)和Fr.4(95%乙醇)。Fr.2(95 g)經(jīng)ODS反相柱色譜，用甲醇-水進(jìn)行梯度洗脫，共得到50個(gè)部分(Fr.2-1 ～Fr.2-50)，其中Fr.2-9 ～Fr.2-14合并，再經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜純化，得到單體化合物DC(250 mg)。

2.1.2 結(jié)構(gòu)鑒定 淺黃色粉末(甲醇)。ESI-MSm/z281.1[M+H]+；279.1[M-H]-，得出化合物分子量為280.1，結(jié)合1H和13C-NMR數(shù)據(jù)信息，確定化合物分子式為C14H16O6。

1H-NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.04(1H，d，J=1.8 Hz，H-2′)，6.77(1H，d，J=8.0 Hz，H-5′)，6.93(1H，dd，J=8.0 Hz，1.8 Hz，H-6′)，7.55(1H，d，J=16.0 Hz，H-7′)，6.25(1H，d，J=16.0 Hz，H-8′)，5.34(1H，m，H-1)，3.73(1H，m，H-2)，4.18(1H，m，H-3)，2.15(2H，m，H-4)，1.95(2H，m，H-5)；13C-NMR(125 MHz，CD3OD)δ：128.1(C-1′)，115.3(C-2′)，149.8(C-3′)，147.4(C-4′)，116.8(C-5′)，123.3(C-6′)，147.1(C-7′)，115.6(C-8′)，169.1(C-9′)，72.3(C-1)，74.0(C-2)，71.9(C-3)，38.5(C-4)，39.4(C-5)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[9]，故鑒定為1-(3′，4′-二羥基肉桂酰基)環(huán)戊烷-2，3-二醇。結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。

圖1 1-(3′，4′-二羥基肉桂酰基)環(huán)戊烷-2，3-二醇的化學(xué)結(jié)構(gòu)

2.2 DC含量測(cè)定方法的建立

2.2.1 色譜條件 Inertsil ODS-3 C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈(A)-0.05%三氟乙酸水溶液(B)，梯度洗脫(0 ～20 min，5%→20%A)，流速為1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為325 nm，柱溫為30 ℃。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取經(jīng)減壓干燥后的DC對(duì)照品5.84 mg，置50 mL量瓶中，用70%甲醇水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得0.116 8 mg·mL-1對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液3 mL，置于15 mL量瓶中，加70%甲醇水稀釋至刻度，搖勻，即得0.023 36 mg·mL-1對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品粉末(過(guò)三號(hào)篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇水25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理45 min(功率250 W，頻率35 kHz)，放冷，再稱定質(zhì)量，加70%甲醇水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 系統(tǒng)適用性及專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液及空白溶劑各10 μL，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，見(jiàn)圖2。在該色譜條件下，供試品溶液色譜圖中具有與對(duì)照品溶液色譜圖中DC對(duì)照品相同保留時(shí)間的色譜峰，空白溶劑在此峰位無(wú)吸收，證明陰性無(wú)干擾。樣品中待測(cè)目標(biāo)物與其他成分均可達(dá)到基線分離，分離度均大于1.5，分離效果好。

注：A.對(duì)照品；B.供試品；C.空白溶劑；1.1-(3′，4′-二羥基肉桂?；?環(huán)戊烷-2，3-二醇。圖2 川芎供試品和對(duì)照品液相色譜圖

2.2.5 線性關(guān)系考察 分別精密吸取2.2.2項(xiàng)下0.023 36 mg·mL-1對(duì)照品溶液1、3、5、10 μL及0.116 8 mg·mL-1對(duì)照品貯備液3、5、10 μL，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，對(duì)照品進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為Y=1 481.35X-3 172.54(r=1.000 0)，結(jié)果表明DC進(jìn)樣量在0.023 36 ～1.168 0 μg范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.6 儀器精密度試驗(yàn) 精密吸取0.023 36 mg·mL-1DC對(duì)照品溶液10 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定色譜峰面積，結(jié)果RSD為0.11%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批(批號(hào)：160606)川芎藥材粉末，按2.2.3項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，依法測(cè)定含量，結(jié)果川芎中DC的平均含量為1.082 mg·g-1，RSD為 1.61%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取2.2.7項(xiàng)下同一供試品溶液，分別在0、2、6、10、14、20 h進(jìn)樣，計(jì)算DC峰面積的RSD為0.51%，表明供試品溶液在20 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.9 加樣回收試驗(yàn) 稱取已知含量的川芎藥材粉末(批號(hào)：160606)6份，每份約0.25 g，精密稱定，分別加入DC對(duì)照品貯備液2 mL，按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 川芎中DC加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.2.10 樣品測(cè)定 取不同批號(hào)的川芎樣品0.5 g，每批樣品平行3份，精密稱定，按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，并用外標(biāo)法計(jì)算樣品中DC的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 川芎樣品中DC含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)色譜、波譜方法，從川芎水提液中分離鑒定水溶性化學(xué)成分DC，該成分系首次從川芎中分離得到。文獻(xiàn)報(bào)道DC具有很強(qiáng)的抗氧化活性，與合成抗氧化劑BHT、TBHQ活性相當(dāng)，但合成抗氧化劑存在安全性問(wèn)題，使其應(yīng)用受到很大限制，故從傳統(tǒng)中藥川芎中分得高效無(wú)毒的天然抗氧化活性物質(zhì)DC具有十分重要的意義。

本文比較過(guò)超聲提取和熱回流提取對(duì)DC含量測(cè)定的影響，結(jié)果顯示無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，因超聲提取操作方便，故最終選擇超聲提取。考察過(guò)甲醇、70%甲醇、50%甲醇、30%甲醇作為提取溶劑，超聲時(shí)間分別為30、45、60 min時(shí)的提取效率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明最佳提取工藝為70%甲醇超聲45 min。本文建立的含量測(cè)定方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，含量測(cè)定結(jié)果表明川芎中均含有較高含量的DC，可為川芎藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定及資源的開(kāi)發(fā)利用提供參考。