PI3K/Akt通路介導LPS調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞HSPA12B表達的研究

王萍

星形膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)量最多、分布最廣泛的免疫效應細胞，可在致炎因子刺激下被激活，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥過程中發(fā)揮損傷和修復的雙向作用[1]。星形膠質(zhì)細胞的促炎功能曾被認為沒有小膠質(zhì)細胞來得突出[2]，但星形膠質(zhì)細胞激活、合成和分泌一系列細胞因子，是神經(jīng)系統(tǒng)諸多疾病損傷的病理特征反應，參與多種神經(jīng)退行性疾病進程，如阿爾茨海默病、帕金森病和多發(fā)性硬化癥等[3]。熱休克蛋白A12B（HSPA12B）是HSP70超家族的一員，不同于與該家族其它成員，有自己特異的結(jié)構(gòu)和功能[4]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)應激過程中，HSPA12B發(fā)揮保護作用，可抑制神經(jīng)細胞凋亡，維持血腦屏障通透性，減少腦缺血缺氧梗死面積等[5-6]。本研究團隊前期報道了HSPA12B作為炎癥反應蛋白在中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥過程中表達上調(diào)，參與星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞的炎性活化過程[7]。脂多糖（LPS）可刺激星形膠質(zhì)細胞誘導HSPA12B表達上調(diào)，HSPA12B在細胞核內(nèi)明顯聚集[8]。有研究指出，磷脂酰肌醇-3-激酶/絲氨酸-蘇氨酸蛋白kinase B（PI3K/Akt）信號通路參與調(diào)節(jié)HSPA12B的神經(jīng)保護作用和炎癥反應過程[6]。PI3K/Akt信號通路廣泛存在于神經(jīng)細胞中，具有調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、抗凋亡等生物學作用[9]?；诖?，本研究旨在評價PI3K/Akt通路的活化對LPS誘導的星形膠質(zhì)細胞HSPA12B表達的影響，探討HSPA12B對中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥過程的可能調(diào)節(jié)機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 新生1～2d以內(nèi)的SD大鼠來源于南通大學實驗動物中心。DMEM/F12培養(yǎng)基、FBS購自美國Gibco公司；胰蛋白酶購自美國HyClone公司；LPS購自美國Sigma公司；TritionX 100、Hoechst購自北京索萊寶科技有限公司；PI3K/Akt通路抑制劑LY294002購自美國Selleck公司，抗-HSPA12B多克隆抗體（美國Sigma公司，HPA13659-100UL，R04942）；抗-phosphor-Akt（p-Akt）抗體（美國Abcam公司，ab81283，GR150067-1）；抗-Akt抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，10176-2-AP，00061348）；抗-GAPDH 抗體（美國 Proteintech公司，60004-1-lg）。CLAS100型細胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司；電泳儀、蛋白印記檢測系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 取新生SD大鼠參照李曉紅等[10]報道的方法進行大腦皮層星形膠質(zhì)細胞原代培養(yǎng)純化。隨機將處于對數(shù)生長期的星形膠質(zhì)細胞分為3組：con組（空白對照）、LPS組（1μg·ml-1LPS刺激4h[8]）、LPS+LY組（20μmol·L-1LY294002 預處理 1h+1μg·ml-1LPS 刺激4h）。

1.2.2 細胞 HSPA12B、p-Akt蛋白表達檢測 采用Western blot法。常規(guī)提取各組細胞總蛋白，采用Bradford法進行蛋白質(zhì)定量。一抗為抗-HSPA12B、Akt、p-Akt、GAPDH抗體，二抗為HRP標記的山羊抗兔及山羊抗小鼠抗體。4h后，用ECL（pierce）進行檢測，柯達膠片曝光顯影，以GAPDH為內(nèi)參，目的蛋白與GAPDH的灰度比值代表蛋白表達水平，實驗重復3次，取平均值。

1.2.3 細胞HSPA12B免疫熒光強度檢測 采用細胞免疫熒光染色法。各組原代星形膠質(zhì)細胞種到蓋玻片上，貼壁后分組處理。4%多聚甲醛室溫固定45min，0.01mol/L PBS漂洗3次，每次10min，加5%山羊血清室溫封閉2h，加抗-HSPA12B抗體，4℃過夜，0.01mol/L PBS漂洗3次，每次10min，加入二抗FITC偶聯(lián)的山羊抗兔IgG及Hoechst，4℃避光孵育1h。熒光封片劑封片后熒光顯微鏡下觀察細胞熒光強度。

1.3 觀察指標 觀察并比較LPS組、LPS+LY組、con組星形膠質(zhì)細胞的HSPA12B、p-Akt蛋白表達水平及HSPA12B熒光強度。

1.4 統(tǒng)計學處理 應用Stata 12.0統(tǒng)計軟件；每組數(shù)據(jù)來自3次獨立的實驗，計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 LPS組、LPS+LY組、con組星形膠質(zhì)細胞HSPA12B、p-Akt蛋白表達水平比較 見圖1。

圖1 LPS組、LPS+LY組、con組星形膠質(zhì)細胞HSPA12B、p-Akt蛋白表達水平比較

由圖1可見，LPS組、LPS+LY組、con組星形膠質(zhì)細胞HSPA12B、p-Akt蛋白表達水平比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；與con組比較，LPS組星形膠質(zhì)細胞HSPA12B、p-Akt蛋白表達水平均上調(diào)（均P＜0.05）；而與LPS組比較，LPS+LY組星形膠質(zhì)細胞HSPA12B、p-Akt蛋白表達水平均下調(diào)（均P＜0.05）。即LPS可刺激星形膠質(zhì)細胞HSPA12B蛋白表達，而PI3K/Akt通路抑制劑LY294002可抑制LPS誘導的HSPA12B的蛋白表達。

2.2 LPS組、LPS+LY組、con組星形膠質(zhì)細胞HSPA12B熒光強度比較 見圖2。

由圖2可見，免疫熒光染色顯示，LPS組星形膠質(zhì)細胞HSPA12B熒光強度強于con組，而LPS+LY組星形膠質(zhì)細胞HSPA12B熒光強度較LPS組減弱。

圖2 LPS組、LPS+LY組、con組星形膠質(zhì)細胞HSPA12B熒光強度比較（免疫熒光染色，bar:10μm）

3 討論

炎癥反應是神經(jīng)系統(tǒng)損傷與神經(jīng)退行性疾病進行性發(fā)展的關(guān)鍵機制[11]。本研究探討PI3K/Akt通路是否調(diào)控LPS誘導星形膠質(zhì)細胞HSPA12B的表達。LPS 1μg·ml-1作用4h后，星形膠質(zhì)細胞HSPA12B表達上調(diào)，同時p-Akt表達水平亦上調(diào)，應用PI3K/Akt通路抑制劑LY294002預處理星形膠質(zhì)細胞能明顯抑制LPS誘導HSPA12B蛋白的表達。

星形膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的細胞成分，在LPS及LPS誘導的細胞因子應答過程中，星形膠質(zhì)細胞發(fā)生活化，通過炎癥放大和神經(jīng)元損失參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)退行性變[12]，與阿爾茨海默病、帕金森病等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。HSP70在中樞神經(jīng)系統(tǒng)應激過程中高表達，這一現(xiàn)象被認為與炎癥過程中HSP70的神經(jīng)保護作用密切相關(guān)[13]。HSPA12B是最近發(fā)現(xiàn)的HSP70家族的新成員。在LPS誘導的炎癥過程中，HSPA12B發(fā)揮保護性作用，HSPA12B參與調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞的炎癥反應，過表達HSPA12B可以減弱血管內(nèi)皮細胞的炎性反應，從而保護心臟功能、抑制炎癥因子的合成[14]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥過程中，本研究團隊曾報道HSPA12B作為炎癥反應蛋白參與小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞的活化，調(diào)節(jié)LPS活化的星形膠質(zhì)細胞中炎癥因子（TNF-α、IL-1β）的表達[15]。LPS 活化星形膠質(zhì)細胞，PI3K/Akt發(fā)生磷酸化增強。PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導通路是參與細胞活化增殖調(diào)控的重要信號通路，在星形膠質(zhì)細胞的活化和增殖中起調(diào)節(jié)作用。PI3K/Akt通路參與介導HSPA12B的保護性作用過程：介導HSPA12B的心臟保護作用；調(diào)節(jié)HSPA12B誘導的內(nèi)皮細胞遷移和炎癥因子的釋放；參與HSPA12B在腦缺血損傷中的抑制神經(jīng)細胞凋亡與腦缺血/腦保護再灌注損傷[16]。本研究通過抑制PI3K/Akt通路，檢測對LPS誘導的星形膠質(zhì)細胞活化過程中HSPA12B表達的影響。應用PI3K/Akt通路的抑制劑LY294002預處理星形膠質(zhì)細胞，LPS誘導的HSPA12B的蛋白表達受到抑制，細胞免疫熒光也顯示，HSPA12B細胞核內(nèi)表達明顯減弱。本研究結(jié)果表明，PI3K/Akt通路參與調(diào)節(jié)LPS誘導活化的星形膠質(zhì)細胞HSPA12B的表達，調(diào)節(jié)炎癥反應過程。

綜上所述，LPS通過PI3K/Akt通路調(diào)節(jié)炎性活化過程中星形膠質(zhì)細胞HSPA12B的表達，抑制PI3K/Akt途徑活化可使LPS刺激的星形膠質(zhì)細胞HSPA12B表達下調(diào)。