黃芪對細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白A誘導(dǎo)異常增殖的大鼠系膜細(xì)胞的影響

陳越 彭莉 鄭巧 郝炎 唐志剛

IgA腎病是一組以反復(fù)發(fā)作性肉眼血尿或鏡下血尿?yàn)橹饕R床表現(xiàn)、腎小球系膜區(qū)IgA沉積為腎活檢主要特征的原發(fā)性腎小球疾病[1]。IgA腎病是我國原發(fā)性腎小球腎炎最常見的類型，約占40%～47.2%[2]，其中發(fā)展為終末期腎病的患者可占20%～30%，已成為導(dǎo)致慢性腎功能衰竭最主要的腎小球疾病[3]。腎小球系膜細(xì)胞異常增殖是IgA腎病發(fā)生、發(fā)展的重要病理基礎(chǔ)[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白A（CagA）具有促進(jìn)大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖與細(xì)胞外基質(zhì)分泌的作用[6]。中藥制劑黃芪注射液因具有活血化瘀、益氣補(bǔ)血的作用，廣泛應(yīng)用于腎病綜合征等多種腎臟疾病的治療，但其作用機(jī)制尚未完全清楚[7]。基于此，本研究通過觀察黃芪對CagA誘導(dǎo)異常增殖的大鼠系膜細(xì)胞的影響，探討其抑制系膜細(xì)胞增殖的作用機(jī)制，以期為IgA腎病的防治研究提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 大鼠系膜細(xì)胞株（HBZY-1）由西南醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室惠贈；IL-1β試劑為美國R&D公司產(chǎn)品；幽門螺桿菌（Hp）CagA購自上海合星生物科技有限公司；1640培養(yǎng)基為美國Gibco公司產(chǎn)品；黃芪注射液由成都地奧九鴻制藥廠生產(chǎn)，每安瓿2ml，2g/ml，批號0306052；FBS購自美國Gibco公司；SABC免疫組化染色試劑盒為北京中杉金橋公司產(chǎn)品，批號AP9023；CCK-8試劑盒為北京賽馳生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 大鼠系膜細(xì)胞培養(yǎng) 把復(fù)蘇好的系膜細(xì)胞放入由1640培養(yǎng)基加入滅活FBS（56℃滅活）配置好的細(xì)胞培養(yǎng)基中，并在培養(yǎng)基中加入鏈霉素、青霉素，終濃度分別為0.1mg/ml和100U/ml。把培養(yǎng)瓶置于5%二氧化碳、37℃孵箱內(nèi)，使用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長，選擇3至6代的系膜細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞分組 大鼠系膜細(xì)胞接種并充分洗滌后，根據(jù)不同的干預(yù)方法分為4組：（1）空白對照組；（2）IL-1β（10ng/ml）陽性對照組（IL-1β 濃度參考文獻(xiàn)[8]）；（3）CagA（4μg/ml）實(shí)驗(yàn)組（CagA 濃度參考文獻(xiàn)[5]）；（4）CagA+黃芪干預(yù)組:加入4μg/ml的CagA和1mg/ml的黃芪注射液（黃芪濃度參考文獻(xiàn)[6]）。

1.2.3 細(xì)胞增殖能力檢測 采用CCK-8法。系膜細(xì)胞培養(yǎng)生長至70%融合，胰酶消化后稀釋調(diào)整細(xì)胞濃度為103/ml，接種于96孔板200μl/孔（板的四周孔加入200μl無菌PBS液以保濕），37℃、5%二氧化碳環(huán)境培養(yǎng)6～8h，待系膜細(xì)胞貼壁后，換用冷凍不含血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24h使系膜細(xì)胞同步化，均處于靜止期。而后按上述分組方法換用含有血清的培養(yǎng)基，4孔/每組。在培養(yǎng)箱中孵育72h后，加入CCK-8試劑20μl/孔，孵育4h，37℃上下左右的混合震蕩培養(yǎng)板15min，上酶標(biāo)儀檢測450nm的OD值，OD值越大代表細(xì)胞增殖能力越強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次，取平均值。

1.2.4 增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）表達(dá)水平檢測 采用免疫組化染色法。大鼠系膜細(xì)胞生長至80%融合后，消化重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液接種于6孔板內(nèi)圓形爬片（事先泡酸、消毒、烘干后備用，并于實(shí)驗(yàn)前用鼠尾膠原Ⅰ處理圓形爬片）上，每個(gè)圓形爬片200μl，37℃、5%二氧化碳孵育30min，大部分細(xì)胞貼壁后，輕輕補(bǔ)加培養(yǎng)液至2ml，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，換無血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)24h使其生長同步化。按上述分組方法處理細(xì)胞，4孔/每組，待72h后取出爬片，按SABC免疫組化染色試劑盒操作步驟檢測PCNA的表達(dá)。用PBS液代替一抗作為對照（呈陰性），使用Image-Pro Plus6.0的軟件對染色結(jié)果進(jìn)行分析，運(yùn)用光密度分析及免疫組化圖像測量平均光密度值（IOD值），IOD值=累計(jì)光密度值/細(xì)胞數(shù)目。IOD值越大代表PCNA表達(dá)水平越高。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察并比較4組大鼠系膜細(xì)胞增殖能力與PCNA表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件；計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠系膜細(xì)胞增殖能力比較 見表1。

表1 4組大鼠系膜細(xì)胞增殖能力比較（IOD值）

由表1可見，4組大鼠系膜細(xì)胞增殖能力比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），IL-1β 陽性對照組、CagA 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖能力均較空白對照組明顯增強(qiáng)（均P＜0.05），CagA+黃芪干預(yù)組細(xì)胞增殖能力較CagA實(shí)驗(yàn)組減弱（P＜0.05）。這一結(jié)果提示黃芪對CagA誘導(dǎo)異常增殖的大鼠系膜細(xì)胞有明顯抑制作用。

2.2 4組大鼠系膜細(xì)胞PCNA表達(dá)水平比較 見圖1、表2。

圖1 4組大鼠系膜細(xì)胞PCNA表達(dá)免疫組化染色所見（×200）

表2 4組大鼠系膜細(xì)胞PCNA表達(dá)水平比較

由圖1、表2可見，4組大鼠系膜細(xì)胞PCNA表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），IL-1β陽性對照組、CagA實(shí)驗(yàn)組系膜細(xì)胞PCNA表達(dá)水平均較空白對照組明顯升高（均P＜0.05），CagA+黃芪干預(yù)組系膜細(xì)胞PCNA表達(dá)水平較CagA實(shí)驗(yàn)組降低（P＜0.05）。即對于CagA誘導(dǎo)異常增殖后的大鼠系膜細(xì)胞，黃芪干預(yù)可明顯降低細(xì)胞PCNA表達(dá)水平。

3 討論

IgA腎病是全球范圍內(nèi)最為常見的原發(fā)性腎小球疾病，也是導(dǎo)致終末期腎衰竭的主要原因之一，其病理特征是以包括IgA為主的免疫復(fù)合物在腎小球系膜區(qū)沉積為主要表現(xiàn)，其中沉積的IgA主要以二聚體或多聚體的形式存在[9]。而正常情況下，IgA二聚體全部由黏膜組織產(chǎn)生，從而提示腎臟沉積的IgA可能是腎外黏膜組織受抗原刺激后產(chǎn)生的IgA分子在“錯(cuò)誤”的地點(diǎn)和“錯(cuò)誤”的時(shí)間出現(xiàn)，進(jìn)而沉積在腎小球系膜區(qū)，啟動了IgA腎病的發(fā)生與發(fā)展。有研究指出，黏膜免疫功能紊亂引起糖基化相關(guān)酶類如β-1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶及其分子伴侶Cosmc的表達(dá)和（或）活性異常，使黏膜淋巴組織B細(xì)胞產(chǎn)生的IgA分子O-糖鏈糖基化異常，是導(dǎo)致IgA腎病發(fā)生、發(fā)展的主要機(jī)制[10]。因此，有學(xué)者認(rèn)為IgA腎病發(fā)病機(jī)制研究的方向應(yīng)以扁桃體等黏膜組織免疫功能紊亂為主[11]。而扁桃體切除術(shù)的確能使部分IgA腎病患者的生活質(zhì)量有所提高，尿檢異常有所改善、腎功能保持相對穩(wěn)定，這進(jìn)一步提示扁桃體可能是IgA腎病的致病抗原所在場所之一[12-13]。

Hp是一種革蘭陰性微需氧菌，CagA是其主要的效應(yīng)蛋白之一。CagA破壞胃上皮細(xì)胞，導(dǎo)致黏膜損傷、組織炎癥甚至誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生，在消化性潰瘍等胃腸道疾病、Hp感染方面起關(guān)鍵的致病作用。此外，有報(bào)道稱Hp在腎小球系膜區(qū)彌漫性、球形分布，證明Hp感染與IgA腎病的發(fā)病有關(guān)[14]。Hp可能是IgA腎病的重要致病抗原。CagA作為Hp主要的效應(yīng)蛋白之一，具有促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)分泌的作用[15]。既往研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β在體外試驗(yàn)中亦可促進(jìn)系膜的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)分泌[16]，因此IL-1β作為本實(shí)驗(yàn)的陽性對照。

具有益氣補(bǔ)腎、活血化瘀作用的中藥制劑黃芪注射液現(xiàn)在臨床廣泛應(yīng)用于多種腎臟疾病的治療，有提高血漿白蛋白、減輕腎損害的作用，但其作用機(jī)制尚不明確[17]。本研究結(jié)果顯示，對于CagA誘導(dǎo)異常增殖后的大鼠系膜細(xì)胞，黃芪干預(yù)可明顯抑制細(xì)胞增殖。PCNA在細(xì)胞周期G1晚期表達(dá)開始增加，在S期達(dá)到高峰，其表達(dá)可反應(yīng)細(xì)胞增殖的程度。本研究結(jié)果顯示，對于CagA誘導(dǎo)異常增殖后的大鼠系膜細(xì)胞，黃芪干預(yù)可明顯降低細(xì)胞PCNA表達(dá)水平。

綜上所述，IgA腎病是一種多病因引起的以腎小球系膜區(qū)IgA沉積為主的系膜增生性腎小球腎炎，系膜細(xì)胞異常增殖與IgA腎病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，作為一種經(jīng)典的中藥，黃芪或通過降低PCNA的表達(dá)水平，抑制CagA誘導(dǎo)異常增殖的大鼠系數(shù)細(xì)胞增殖能力，可為IgA腎病提供新的治療思路。