PANDAR在分化型甲狀腺癌中的表達及臨床意義研究

高衛(wèi)利 葉國超 劉力偉

CDKN1A反義鏈啟動子DNA損傷激動RNA（promoter of CDKN1A antisense DNA damage activated RNA，PANDAR）是一種長度為1 506個核苷酸并定位于6p21.2的長鏈非編碼RNA（LncRNA）[1]。越來越多的研究證據(jù)表明，PANDAR參與胃癌、肝細胞癌、膀胱癌等多種人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，是腫瘤的重要基因調(diào)節(jié)因子和預(yù)后生物標(biāo)志物之一。因此，本研究通過檢測PANDAR在分化型甲狀腺癌（DTC）中的表達水平，探討PANDAR在DTC中表達的臨床意義，現(xiàn)報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2010年1至12月在本院行手術(shù)切除治療的97例DTC患者的DTC組織及其配對的癌旁正常組織（距癌組織＞2cm）?；颊咧心?2例，女75例；年齡 18～79（42.0±12.4）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）患者頸部未曾受放射線照射治療；（2）由常規(guī)病理學(xué)檢查確診DTC；（3）年齡18～80歲；（4）排除合并心、肝、肺、腎等臟器嚴(yán)重功能不全者；（5）合并其他惡性腫瘤者?；颊咝g(shù)中切除的組織標(biāo)本放入RNAlater保存試劑保存于-80℃液氮中凍存，于2013年初進行以下實驗操作。

1.2 方法

1.2.1 DTC組織、癌旁正常組織PANDAR表達水平檢測 采用qRT-PCR法。應(yīng)用TRIzol試劑（美國Invitrogen公司），按說明書所述方法提取DTC組織、癌旁正常組織總RNA。使用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑PrimeScriptTMRT reagent Kit（日本TaKaRa公司），按說明書所述方法進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。按照qRT-PCR試劑盒SYBRPremix Ex TaqTM（日本TaKaRa公司）說明書的方法，以合成的cDNA為模板，加入反應(yīng)試劑進行qRTPCR反應(yīng)。PANDAR正義鏈為 5′-CTGTTAAGGTGGTGGCATTG-3′，反義鏈為 5′-GGAGGCTCATACTGGCTGAT-3′。GAPDH 正義鏈為 5′-CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3′，反義鏈為 5′-ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC-3′。以GAPDH為內(nèi)參進行標(biāo)準(zhǔn)化處理，采用△△Ct法計算PANDAR的相對表達水平。

1.2.2 DTC組織BRAFV600E突變情況檢測 采用PCR法，具體方法詳見本團隊先前研究報道[2]。DTC組織進行DNA抽提后進行PCR擴增，設(shè)計引物：上游引物 5′-TCATAATGCTTGCTCTGATAGGA-3′；下游引物5′-GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA-3′。然后瓊脂糖凝膠電泳檢測：PCR產(chǎn)物加入瓊脂糖凝膠的點樣孔中，觀察樣品彌散條帶及凝像分析。最后進行DNA雙向測序，以證實PCR結(jié)果的可靠性，并將測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫進行比對以確定BRAFV600E有無突變。

1.3 觀察指標(biāo) （1）觀察并比較DTC組織、癌旁正常組織PANDAR表達水平；（2）以97例DTC患者的DTC組織PANDAR表達水平平均值為截點，將患者分為PANDAR高表達組（≥平均值）、低表達組（＜平均值），比較PANDAR高表達組與低表達組DTC患者臨床病理特征與BRAFV600E突變情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件；計量資料以表示，組間比較采用配對t檢驗；計數(shù)資料以頻數(shù)和構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DTC組織、癌旁正常組織PANDAR表達水平比較DTC組織、癌旁正常組織PANDAR表達水平分別為3.684±0.089、1.273±0.078，DTC 組織 PANDAR 表達水平明顯高于癌旁正常組織（P＜0.05）。

2.2 PANDAR高表達組與低表達組DTC患者臨床病理特征比較 以DTC患者的DTC組織PANDAR表達的平均值3.684為截點，PANDAR高表達組患者56例，低表達組41例。兩組患者性別、年齡、腫瘤直徑、病理類型、腫瘤個數(shù)、有無侵犯包膜情況比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；與PANDAR低表達組比較，PANDAR高表達組患者T分期較晚、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率較高、TNM分期較晚、腫瘤復(fù)發(fā)率較高（均P＜0.05），見表1。

表1 PANDAR高表達組與低表達組DTC患者臨床病理特征比較[例（%）]

2.3 PANDAR高表達組與低表達組DTC患者BRAFV600E突變情況比較 PANDAR高表達組患者中BRAFV600E突變48例（85.7%），低表達組中BRAFV600E突變22例（53.7%）。PANDAR高表達組患者BRAFV600E突變率高于低表達組（P＜0.05）。

3 討論

甲狀腺癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，國民發(fā)病率有逐年上升趨勢[3]。DTC是分化良好的甲狀腺癌病理類型，約占所有甲狀腺癌的80%～90%。目前進展期DTC患者的數(shù)量及其發(fā)生腫瘤相關(guān)性病死率還在不斷上升[4]。因此，尋找新型生物標(biāo)志物以提高DTC的診治水平、改善患者預(yù)后，具有重要的臨床意義。

LncRNA是一類長度在200個核苷酸以上，不具有蛋白質(zhì)編碼功能的RNA，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。近來研究表明，LncRNA在參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、染色體重塑、轉(zhuǎn)錄后蛋白修飾、調(diào)控蛋白的功能和穩(wěn)定性、癌細胞耐藥性等方面起著重要的作用[5-12]。最初，Hung等[1]發(fā)現(xiàn)，PANDAR是一種長度為1 506個核苷酸并定位于6p21.2新型LncRNA。PANDAR在成纖維細胞DNA損傷反應(yīng)中，被p53誘導(dǎo)激活，并通過與核轉(zhuǎn)錄因子NF-YA的相互作用，抑制促凋亡基因的表達，從而抑制細胞凋亡；DNA損傷和轉(zhuǎn)錄因子NF-YA與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[13-14]。因此，PANDAR可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。

研究發(fā)現(xiàn)，PANDAR參與多種人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，而且在不同階段扮演著雙重角色。PANDAR在肝細胞癌[15]、膀胱癌[16]、胃癌[17]、結(jié)直腸癌[18]、宮頸癌[19]、腎癌[20]、膽管癌[21]中表達上調(diào)，且PANDAR的高表達與患者的臨床病理特征與預(yù)后密切相關(guān)，可促進腫瘤細胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移。然而，在肺癌研究中，Han等[22]發(fā)現(xiàn)PANDAR在非小細胞肺癌組織中表達下調(diào)，且PANDAR低表達水平與腫瘤分期、腫瘤大小以及患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。

在甲狀腺癌研究中，Li等[23]采用qRT-PCR法檢測DTC中PANDAR的表達，發(fā)現(xiàn)PANDAR在DTC中表達上調(diào)。本研究采用qRT-PCR法檢測PANDAR在DTC組織及配對的癌旁正常組織中的表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PANDAR在DTC組織中的表達水平明顯高于癌旁正常組織，并且與DTC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、T分期及TNM分期密切相關(guān)。同時PANDAR的高表達與DTC患者腫瘤復(fù)發(fā)密切相關(guān)。這說明PANDAR在DTC中是一種促癌基因，在DTC的發(fā)生、發(fā)展中起著一定的作用。因此，PANDAR或可成為評估DTC患者預(yù)后的生物標(biāo)志物之一。

在BRAF突變中，BRAFV600E突變（T1977A點突變）占90%以上。在DTC中，BRAFV600E突變是最常見的基因事件，文獻報道BRAFV600E在DTC中的突變率有很大的差異，為29%～83%[24]。BRAFV600E突變與DTC中甲狀腺包膜外浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床病理分級等臨床病理特征及患者預(yù)后密切相關(guān)[25]。本研究結(jié)果顯示，PANDAR高表達組患者BRAFV600E突變率高于低表達組。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，PANDAR在DTC組織中表達上調(diào)，PANDAR高表達的DTC患者預(yù)后較差。PANDAR或可成為評估DTC患者預(yù)后的生物標(biāo)志物之一。