不同復(fù)合微生態(tài)制劑添加方式對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)、非特異性免疫及抗病力的影響*

劉龍鎮(zhèn)，田相利,2**，王明陽(yáng)，李海東，李 麗,2，董雙林,2，馬家好

(1.海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國(guó)海洋大學(xué))，山東 青島 266003；2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266235；3.廣州金水動(dòng)物保健品有限公司，廣東 廣州 510510)

凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)俗稱(chēng)南美白對(duì)蝦，因其具有環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)、生長(zhǎng)速度快、抗病能力強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，成為我國(guó)養(yǎng)殖范圍最廣、產(chǎn)量最高的對(duì)蝦種類(lèi)[1]。凡納濱對(duì)蝦于1988年引進(jìn)我國(guó)后，其養(yǎng)殖便迅速遍及全國(guó)[2]。然而，隨著對(duì)蝦集約化養(yǎng)殖的迅速發(fā)展，養(yǎng)殖水環(huán)境惡化、病害頻發(fā)等諸多問(wèn)題日益嚴(yán)峻，嚴(yán)重影響了對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

目前，國(guó)際上將微生態(tài)制劑分成3個(gè)類(lèi)型：益生菌(Probitics)、益生元(Prebiotics)和合生素(Synbiotics)[3]。益生菌是指一類(lèi)對(duì)宿主有益的活性微生物，能在一定范圍內(nèi)增進(jìn)動(dòng)物健康的活體微生物制劑，其作為抗生素的替代品，近幾年已得到迅速發(fā)展[4-5]。研究表明，益生菌不僅能夠降低養(yǎng)殖水體的氨氮、亞硝酸氮含量，改善水質(zhì)[6-7]；還可以通過(guò)與有害微生物競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及生存繁殖空間等機(jī)制，抑制有害微生物的生長(zhǎng)繁殖，從而維持機(jī)體腸道微生態(tài)平衡[5]。與此同時(shí)，益生菌還可有效提高養(yǎng)殖生物體有關(guān)免疫酶活性，促進(jìn)養(yǎng)殖生物體對(duì)飼料中蛋白營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，增強(qiáng)抗病性，提高成活率及增長(zhǎng)率。目前益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中備受廣大學(xué)者和養(yǎng)殖戶(hù)所青睞，被視為抗生素的有力替代品之一[8-9]。而一般認(rèn)為，微生態(tài)制劑與酶制劑間具有一定的協(xié)同作用[10-11]。飼用酶制劑具有高效、安全、環(huán)保等特點(diǎn)，在飼料工業(yè)中受到越來(lái)越多的重視。復(fù)合酶一般由一種或幾種單一酶制劑為主體，加上其他單一酶制劑混合而成，或者由一種或幾種微生物發(fā)酵獲得[12]。復(fù)合酶制劑能夠彌補(bǔ)胃腸道內(nèi)源酶不足，促進(jìn)養(yǎng)殖生物體對(duì)飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，解除飼料中多種抗?fàn)I養(yǎng)因子，進(jìn)而提高飼料的利用率[13-15]。同時(shí)，還能夠改善胃腸機(jī)能，有效抑制腸道中病原菌的繁殖，并且能夠提高機(jī)體免疫力[16-17]。

微生態(tài)制劑已在凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖中得到廣泛應(yīng)用。然而，由于益生菌和酶制劑無(wú)法耐受對(duì)蝦配合飼料制粒過(guò)程中的高溫，導(dǎo)致在常規(guī)對(duì)蝦制粒工藝中通常難以進(jìn)行添加。而在實(shí)際使用中，手工或通過(guò)拌料機(jī)現(xiàn)場(chǎng)拌料的方式不僅操作麻煩，使用中也存在溶失嚴(yán)重的缺點(diǎn)。本研究比較了幾種不同復(fù)合微生態(tài)制劑添加形式對(duì)凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)、血清非特異性免疫酶活性及抗病力的影響，以期為微生態(tài)制劑科學(xué)復(fù)配及其在凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖中合理應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 微生態(tài)制劑添加方式設(shè)計(jì)

本研究分別設(shè)計(jì)了4個(gè)不同處理和1個(gè)對(duì)照，具體如下：

A為對(duì)照組，即基礎(chǔ)飼料組。僅投喂對(duì)蝦配合飼料(粗蛋白含量42%)，不添加任何微生態(tài)制劑。飼料為由某廠家提供的凡納濱對(duì)蝦全價(jià)配合飼料，粗蛋白含量42%，生產(chǎn)工藝為擠壓成型，后熟化調(diào)質(zhì)。主要成分見(jiàn)表1。

B為拌服復(fù)合菌制劑組，即將液體復(fù)合菌制劑均勻拌到基礎(chǔ)飼料中，于干燥通風(fēng)處自然陰干后儲(chǔ)存于4℃環(huán)境下備用。其中，復(fù)合菌由芽孢桿菌(Bacillusspp.)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)、酪酸菌(Clostridiumbutyricum)等組成，均為活菌。

C為后噴涂復(fù)合菌制劑組，即飼料制粒擠出經(jīng)干燥后，在<90℃溫度下，由后噴涂工藝將復(fù)合菌制劑均勻噴涂到基礎(chǔ)飼料中制成，干燥后水分含量<12%。復(fù)合菌組成和比例同上。其中，芽孢桿菌和酪酸菌為芽孢形式，嗜酸乳桿菌經(jīng)過(guò)包埋工藝處理。

D為復(fù)合菌酶顆粒制劑組，由復(fù)合菌與復(fù)合酶復(fù)配后經(jīng)低溫制粒而成(制粒時(shí)溫度<45℃，干燥后水分含量<12%)，與配合飼料粒徑、形態(tài)上均保持一致。其中，復(fù)合菌組成及比例同上。芽孢桿菌和酪酸菌為芽孢，嗜酸乳桿菌經(jīng)過(guò)包埋工藝處理；復(fù)合酶由消化酶和非淀粉多糖酶等組成，包括蛋白酶、淀粉酶、甘露聚糖酶和木聚糖酶等。使用時(shí)菌酶顆粒制劑添加比例為配合飼料的5%，簡(jiǎn)單摻加即可。

E為固體發(fā)酵制劑組，即在凡納濱對(duì)蝦配合飼料配方組分中添加乳酸菌、酵母和芽孢桿菌等復(fù)合菌固體發(fā)酵培養(yǎng)物，之后擠壓成型(<90℃)，但未經(jīng)后熟化調(diào)質(zhì)，為全價(jià)飼料。主要成分詳見(jiàn)表1。

B、C和D組最終投喂飼料中復(fù)合菌濃度為109cfu/g。

表 1 基礎(chǔ)飼料和添加固體發(fā)酵制劑的飼料主要成分Table 1 Composition of the basic and micro-ecological feed

1.2 實(shí)驗(yàn)用蝦及日常養(yǎng)殖管理

本研究于青島瑞滋海珍品有限公司陽(yáng)光棚進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)所用凡納濱對(duì)蝦購(gòu)于青島市寶榮水產(chǎn)科技發(fā)展有限公司對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)，養(yǎng)殖用水鹽度17。實(shí)驗(yàn)對(duì)蝦購(gòu)買(mǎi)后暫養(yǎng)于400 L白色塑料桶中，進(jìn)行馴化暫養(yǎng)，暫養(yǎng)時(shí)間為10天。暫養(yǎng)期間保持合適充氧，定時(shí)測(cè)定水溫、溶氧，定時(shí)投喂適量基礎(chǔ)飼料。同時(shí)，每天將養(yǎng)殖桶中用水的鹽度提升2，逐漸馴化直到鹽度升至青島瑞滋海珍品有限公司養(yǎng)殖用水的自然鹽度31。馴化暫養(yǎng)結(jié)束后穩(wěn)定3天，進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。

馴化暫養(yǎng)結(jié)束后，將實(shí)驗(yàn)用蝦饑餓一天。之后選取規(guī)格一致、無(wú)病無(wú)傷、健康活潑的凡納濱對(duì)蝦(2.66±0.02)g隨機(jī)放入15個(gè)相同規(guī)格的塑料桶(容積400 L)中，進(jìn)行相關(guān)養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)，每個(gè)水桶分別養(yǎng)殖80尾凡納濱對(duì)蝦蝦苗，每個(gè)處理分別設(shè)置了3個(gè)重復(fù)。整個(gè)養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)一共持續(xù)54天。

每天上午8：30及下午5：00定時(shí)投喂，將飼料投喂到直徑為50 cm餌料盤(pán)中，日投喂量為對(duì)蝦體重的3%～5%(根據(jù)對(duì)蝦的攝食情況調(diào)節(jié)投喂量)。每次投喂前吸出并收集養(yǎng)殖桶和餌料盤(pán)中的殘餌和糞便，并換水1/3～2/3。每天檢查并記錄對(duì)蝦的攝食和死亡情況。

實(shí)驗(yàn)期間，水溫平均在23 ℃左右，溶氧5mg/L以上，鹽度31，pH=8.0±0.1。

1.3 樣品的采集與處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將對(duì)蝦饑餓處理24 h，然后對(duì)每個(gè)養(yǎng)殖桶中的對(duì)蝦進(jìn)行收獲、計(jì)數(shù)、稱(chēng)重。

同時(shí)，每個(gè)養(yǎng)殖桶中隨機(jī)抽取15尾對(duì)蝦進(jìn)行血清采集。首先，用1 mL無(wú)菌注射器從凡納濱對(duì)蝦腹部血竇中緩慢抽取血淋巴置于1.5 mL無(wú)菌離心管中。然后，于4 ℃環(huán)境下靜置過(guò)夜后，3000 r/min離心機(jī)中離心15 min。離心完畢，使用滅菌移液器將上層血清轉(zhuǎn)移至新的無(wú)菌離心管中，置于-80 ℃冰箱中保存待測(cè)。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 生長(zhǎng)指標(biāo) 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前稱(chēng)重并記錄每個(gè)養(yǎng)殖桶中對(duì)蝦的初始重量。養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，清點(diǎn)、記錄對(duì)蝦的末數(shù)量，并稱(chēng)重、記錄每個(gè)養(yǎng)殖桶中對(duì)蝦的末重量。在養(yǎng)殖過(guò)程中記錄各處理組每天的投餌量、收集記錄殘餌量、記錄死蝦的數(shù)量和重量。部分生長(zhǎng)相關(guān)指標(biāo)計(jì)算如下：

成活率=(實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)蝦的末數(shù)量/實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前蝦的初數(shù)量)×100%；

特定生長(zhǎng)率(SGR)= [(lnW末- lnW初) /t]×100%；

餌料系數(shù)=M/(W初+WS-W末)。

式中：W初、W末、WS分別為對(duì)蝦平均初體重、對(duì)蝦平均末體重、養(yǎng)殖過(guò)程中死亡的對(duì)蝦的質(zhì)量；t為養(yǎng)殖時(shí)間；M為養(yǎng)殖過(guò)程中投餌量。

1.4.2 血清中非特異性免疫指標(biāo) 對(duì)各處理對(duì)蝦血清中超氧化物歧化酶(Superoxide dismutse，SOD)、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，AKP)、酸性磷酸酶(Acid phosphatase，ACP)、溶菌酶(Lysozyme，LSZ)、總一氧化氮合酶(Total Nitric Oxide Synthase，TNOS)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(Inducible Nitric Oxide Synthase，iNOS)活性進(jìn)行相關(guān)測(cè)定。以南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的相關(guān)試劑盒進(jìn)行具體測(cè)定，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.4.3 攻毒實(shí)驗(yàn) 養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，保持養(yǎng)殖條件不變，將取樣后剩余的對(duì)蝦正常飼喂3天后進(jìn)行副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)攻毒實(shí)驗(yàn)。其中，每個(gè)處理分別設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15尾蝦。所用副溶血弧菌由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)院黃海水產(chǎn)研究所提供。副溶血弧菌經(jīng)活化后接種于胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)，在28℃條件下振蕩培養(yǎng)18～24 h。之后，顯微鏡下血球計(jì)數(shù)板計(jì)算有效活菌數(shù)。最后，將一定量培養(yǎng)菌液離心5min，用滅菌海水重懸后潑灑到各處理組養(yǎng)殖桶中。攻毒過(guò)程中保證各處理組養(yǎng)殖桶中副溶血弧菌的終濃度為1×108cfu/mL。

攻毒實(shí)驗(yàn)持續(xù)2周，攻毒期間養(yǎng)殖條件不變。每天觀察記錄對(duì)蝦的活力、攝食及死亡情況。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 22軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan's多重比較進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，以P<0.05為差異顯著水平，統(tǒng)計(jì)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean ± S.E.)表示。

2 結(jié)果

2.1 生長(zhǎng)指標(biāo)

不同處理對(duì)蝦的生長(zhǎng)情況見(jiàn)表2?？梢钥闯?，各處理組對(duì)蝦成活率在實(shí)驗(yàn)期間差異不大(P>0.05)。與對(duì)照相比，除拌服復(fù)合菌制劑組外，其余3個(gè)處理組均能夠顯著提高對(duì)蝦的增重率和特定生長(zhǎng)率(P<0.05)。其中，固體發(fā)酵制劑組對(duì)蝦的增重率及特定生長(zhǎng)率均最高。后噴涂復(fù)合菌制劑組、復(fù)合菌酶顆粒制劑組和固體發(fā)酵制劑組餌料系數(shù)均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，但拌服復(fù)合菌制劑組餌料系數(shù)與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。

表2 不同復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)的影響Table 2 Growth performance of L.vannamei fed with different omnibiotics

注：A為對(duì)照組，B為拌服復(fù)合菌制劑組，C為后噴涂復(fù)合菌制劑組，D為復(fù)合菌酶顆粒制劑組，E為固體發(fā)酵制劑組。表中同一列數(shù)據(jù)中不同字母間表示顯著差異(P<0.05)。
Note:A is the control group，B is hand-mixed composite probiotics group，C is spray coating techniques group，D is compound probiotics and enzyme preparation group，E is micro-ecological feed group.Data with different letters at the same column mean significant difference each other (P< 0.05).

2.2 非特異性免疫指標(biāo)

2.2.1 超氧化物歧化酶 由圖1看出，復(fù)合菌酶制劑和固體發(fā)酵制劑組對(duì)蝦血清的超氧化物歧化酶(SOD)活性均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，但拌服與后噴涂復(fù)合微生態(tài)制劑處理組與對(duì)照組差異均不顯著(P>0.05)。不同處理組相比較，以生態(tài)飼料組對(duì)蝦SOD活性最高。

(A為對(duì)照組，B為拌服復(fù)合菌制劑組，C為后噴涂復(fù)合菌制劑組，D為復(fù)合菌酶制劑組，E為固體發(fā)酵制劑組。圖中不同字母間表示顯著差異(P<0.05)。下同。A is the control group，B is hand-mixed composite probiotics group，C is spray coating techniques group，D is compound probiotics and enzyme preparation group，E is micro-ecological feed group.Data with different letters at the same column mean significant difference each other (P< 0.05).The same as below.)

圖1 不同復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)凡納濱對(duì)蝦血清超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響
Fig.1 Effects of different omnibiotics on the activity of superoxide dismutase (SOD) in the serum ofL.vannamei

2.2.2 堿性磷酸酶 由圖2可以看出，復(fù)合菌酶制劑和固體發(fā)酵制劑組對(duì)蝦血清堿性磷酸酶(AKP)活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，但拌服與后噴涂復(fù)合微生態(tài)制劑處理組與對(duì)照組差異均不顯著(P>0.05)。不同處理組相比較，復(fù)合菌酶制劑和固體發(fā)酵制劑組對(duì)蝦血清AKP活性差異不大(P>0.05)，但均顯著高于其他處理組(P<0.05)。

2.2.3 酸性磷酸酶 由圖3可以看出，固體發(fā)酵制劑組和復(fù)合菌酶制劑組對(duì)蝦血清酸性磷酸酶(ACP)活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，但拌服與后噴涂復(fù)合微生態(tài)制劑處理組與對(duì)照組差異均不顯著(P>0.05)。不同處理組相比較，復(fù)合菌酶制劑和固體發(fā)酵制劑組對(duì)蝦血清ACP活性差異不大(P>0.05)，但顯著高于后噴涂復(fù)合微生態(tài)制劑處理組(P<0.05)。

圖2 不同復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)凡納濱對(duì)蝦血清堿性磷酸酶(AKP)活性的影響Fig.2 Effects of different omnibiotics on the activity of alkaline phosphatase(AKP)in the serum of L.vannamei

圖3 不同復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)凡納濱對(duì)蝦血清酸性磷酸酶(ACP)活性的影響Fig.3 Effects of different omnibiotics on the activity of acid phosphatase (ACP) in the serum of L.vannamei

2.2.4 溶菌酶 由圖4可以看出，各處理組對(duì)蝦血清溶菌酶(LSZ)活性均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。不同處理組之間相比較，以固體發(fā)酵制劑組對(duì)蝦LSZ活性最高，但其他處理組之間差異不顯著(P>0.05)。

2.2.5 總一氧化氮合酶(TNOS) 由圖5可以看出，后噴涂微生態(tài)制劑組與固體發(fā)酵制劑組對(duì)蝦血清總一氧化氮合酶(TNOS)活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，但其他2個(gè)處理組與對(duì)照差異不大(P>0.05)。不同處理組相比較，以拌服復(fù)合菌制劑組對(duì)蝦TNOS活性最低，顯著低于其他處理組(P<0.05)。

2.2.6 誘導(dǎo)型一氧化氮合酶 由圖6可以看出，除拌服復(fù)合菌制劑組以外，其他各處理組對(duì)蝦血清誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)活性均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。不同處理組之間相比較，以固體發(fā)酵制劑組對(duì)蝦血清iNOS活性最高，而后噴涂復(fù)合菌制劑組和復(fù)合菌酶制劑組之間差異不大(P>0.05)，但均顯著高于拌服復(fù)合菌制劑組(P<0.05)。

圖4 不同復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)凡納濱對(duì)蝦血清溶菌酶(LSZ)的影響Fig.4 Effects of different omnibiotics on the activity of lysozyme (LSZ) in the serum of L.vannamei

圖5 不同復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)凡納濱對(duì)蝦血清總一氧化氮合酶(TNOS)的影響Fig.5 Effects of different omnibiotics on the activity of total nitric oxide synthase (TNOS) in the serum of L.vannamei

圖6 不同復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)凡納濱對(duì)蝦血清誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)活性的影響Fig.6 Effects of different omnibiotics on the activity of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in the serum of L.vannamei

2.3 攻毒結(jié)果

潑灑副溶血弧菌后，被感染的對(duì)蝦表現(xiàn)為攝食量下降、附肢發(fā)紅、空胃、肝胰腺腫大、不好動(dòng)或沿養(yǎng)殖桶壁漫游，活力弱，直至最后死亡。

圖7顯示了潑灑副溶血弧菌后各處理組對(duì)蝦的累積死亡率情況。從圖7中可看出，各處理組對(duì)蝦在攻毒后陸續(xù)出現(xiàn)死亡，持續(xù)不同時(shí)間之后又逐漸停止死亡。其中，各處理組在攻毒開(kāi)始后3～4天對(duì)蝦開(kāi)始出現(xiàn)死亡，而對(duì)照組在第2天即出現(xiàn)死亡。固體發(fā)酵制劑組對(duì)蝦在攻毒后第7天停止死亡，其他處理組對(duì)蝦在第9～10天逐漸停止死亡。

整個(gè)攻毒實(shí)驗(yàn)期間，固體發(fā)酵制劑組、后噴涂微生態(tài)制劑組和復(fù)合菌酶制劑組對(duì)蝦累積死亡率分別為25.0%、37.5%和50.0%，均顯著低于對(duì)照組(75%)(P<0.05)，而拌服微生態(tài)制劑組對(duì)蝦累積死亡率(68.8%)則與對(duì)照組差異不大(P>0.05)。各處理組之間比較，固體發(fā)酵制劑組對(duì)蝦累積死亡率為最低，拌服微生態(tài)制劑組最高。

圖7 潑灑副溶血弧菌后各處理組凡納濱對(duì)蝦的累計(jì)死亡率Fig.7 The cumulative mortality of L.vannamei challenged with V.parahaemolvticus

3 討論

3.1 不同復(fù)合微生態(tài)制劑及其添加方式對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)的影響

目前，微生態(tài)制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中已得到廣泛應(yīng)用。研究表明，益生菌及其代謝產(chǎn)物可改善動(dòng)物腸道菌群結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)動(dòng)物腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收，從而能夠有效促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)[18-19]。例如，王子彥等發(fā)現(xiàn)，微生物添加劑可顯著提高養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)腸道淀粉酶和蛋白酶的活性[3,20-21]。丁賢等的研究表明，飼喂芽孢桿菌可顯著促進(jìn)凡納濱對(duì)蝦腸道蛋白酶活性，提高對(duì)蝦成活率[22]。然而，目前關(guān)于微生態(tài)制劑的不同添加形式對(duì)其作用效果的影響少見(jiàn)報(bào)道。本研究比較了常用的液體拌服與飼料制粒后噴涂工藝兩種方式對(duì)同種復(fù)合菌制劑作用效果的影響。可以看出，液體拌服處理組對(duì)蝦增重率和特定生長(zhǎng)率與對(duì)照組之間差異不顯著(P>0.05)，而飼料后噴涂工藝處理組均顯著高于液體拌服工藝處理組和對(duì)照組(P<0.05)。究其原因，可能主要與拌服不均勻，且由于附著性差，易使益生菌在水體中溶失而導(dǎo)致對(duì)蝦無(wú)法有效攝食有關(guān)。而采取飼料制粒后噴涂工藝，既可避免飼料在制粒過(guò)程中高溫、高濕對(duì)菌活性產(chǎn)生的破壞[9]，也可將益生菌更均勻的噴灑并滲透到飼料內(nèi)部，避免有效成分的溶失和配方失效[23]，從而能夠使益生菌更有效地被對(duì)蝦所攝食。

酶制劑作為外源性酶制劑添加到飼料中可彌補(bǔ)消化道內(nèi)源性酶的不足。一方面，幼齡動(dòng)物消化道發(fā)育尚不完善，酶的分泌能力相對(duì)較弱，適量補(bǔ)充一些消化酶，對(duì)此階段的生長(zhǎng)有突出的促進(jìn)作用[24]。另一方面，外源性地補(bǔ)充動(dòng)物自身不能分泌的非淀粉多糖酶(甘露聚糖酶、葡聚糖酶、木聚糖酶等)，可以消除日糧中植物細(xì)胞壁的“屏蔽效應(yīng)”，釋放養(yǎng)分[14]，還可以有效消除飼料中抗?fàn)I養(yǎng)因子和某些毒素的有害作用[25]，從而提高對(duì)飼料中各種養(yǎng)分的消化率和吸收率，降低餌料系數(shù)[26]。例如，周小秋等發(fā)現(xiàn)，在鯉魚(yú)(Cyprinuscarpio)飼料中添加復(fù)合酶制劑能夠明顯促進(jìn)鯉魚(yú)生長(zhǎng)，降低餌料系數(shù)[27]。研究表明，酶制劑可以作為一種益生協(xié)同劑，可與益生菌聯(lián)合使用，二者具有良好的協(xié)同性[28]。在本研究中，復(fù)合菌酶制劑由芽孢桿菌、酪酸菌和嗜酸乳桿菌等益生菌以及蛋白酶、淀粉酶等消化酶和甘露聚糖酶、木聚糖酶等非淀粉多糖酶等酶制劑復(fù)配后經(jīng)低溫制粒工藝而制成?？梢钥闯觯c對(duì)照組相比，低溫制粒的復(fù)合菌酶制劑可顯著提高對(duì)蝦的增重率和特定生長(zhǎng)率，顯著降低餌料系數(shù)(P<0.05)，效果優(yōu)于拌服復(fù)合菌制劑組。尹君等研究表明，微生態(tài)制劑與酶制劑共同作用提高了異育銀鯉的消化酶活性[3]。因此，推測(cè)酶與菌制劑協(xié)同使用有效提高了對(duì)蝦對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，促進(jìn)了對(duì)蝦的生長(zhǎng)。

近年來(lái)，微生物發(fā)酵培養(yǎng)物的功能受到廣泛關(guān)注，例如，酵母培養(yǎng)物目前已在畜禽行業(yè)得到廣泛應(yīng)用[29-30]。本研究中的固體發(fā)酵制劑組在飼料中適量添加了部分由乳酸菌、酵母和芽孢桿菌等菌種復(fù)合發(fā)酵培養(yǎng)物。由于此飼料擠壓成型溫度低于90℃，且未經(jīng)后熟化調(diào)質(zhì)，因此在它的成分里，不僅含有部分存活的芽孢桿菌芽孢，還含有乳酸菌、酵母和芽孢桿菌等微生物細(xì)胞內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物，以及發(fā)酵后產(chǎn)生的微生物代謝產(chǎn)物，甚至很多未知活性因子。從養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，盡管生態(tài)飼料蛋白含量(36%)較對(duì)照組基礎(chǔ)飼料蛋白含量低(42%)，但對(duì)蝦的增重率和特定生長(zhǎng)率卻顯著高于其他處理和對(duì)照組(P<0.05)，顯示了最優(yōu)的養(yǎng)殖效果。推測(cè)這可能與添加的微生物復(fù)合發(fā)酵培養(yǎng)物可更有效地改善對(duì)蝦腸道的微生態(tài)環(huán)境、增強(qiáng)腸道消化吸收功能、促進(jìn)對(duì)蝦的健康生長(zhǎng)有關(guān)。

3.2 不同復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)凡納濱對(duì)蝦非特異性免疫指標(biāo)及抗病力的影響

與脊椎動(dòng)物不同，凡納濱對(duì)蝦不具有獲得性免疫系統(tǒng)，主要依靠非特異性免疫系統(tǒng)作為抵御細(xì)菌和疾病的保護(hù)屏障，維持機(jī)體的正常生理平衡[31]。隋大鵬等研究認(rèn)為，對(duì)蝦的溶酶體酶主要來(lái)源于血細(xì)胞和血淋巴，在對(duì)蝦的體液免疫中發(fā)揮重要作用[32]。其中，血淋巴中超氧化物歧化酶(SOD)、堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、溶菌酶(LSZ)、總一氧化氮合酶(TNOS)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)等活性是主要的評(píng)價(jià)指標(biāo)[33]。

研究表明，益生菌及其代謝物可以作為良好的免疫激活劑，通過(guò)激發(fā)機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫來(lái)增強(qiáng)機(jī)體免疫機(jī)能[4]，其作用機(jī)理可能是通過(guò)細(xì)菌本身或細(xì)胞壁成分刺激非特異性免疫系統(tǒng)使其發(fā)揮作用，從而提高動(dòng)物免疫力[25]。本研究中，不同復(fù)合微生態(tài)制劑添加形式對(duì)凡納濱對(duì)蝦血清非特異免疫能力影響有所差別。其中，拌服復(fù)合菌制劑僅對(duì)蝦血清LSZ活性有提高作用，后噴涂復(fù)合菌制劑顯著提高了血清SOD、LSZ、TNOS和iNOS活性，而飼料中添加復(fù)合菌酶制劑則能夠顯著提高SOD、AKP、ACP、LSZ和iNOS的活性。而相比較，固體發(fā)酵制劑組在所有非特異免疫指標(biāo)中幾乎都顯示出最佳的效果。分析其原因，后噴涂工藝使復(fù)合菌有效滲入飼料內(nèi)部，避免了益生菌在水體中的溶失，促進(jìn)了對(duì)蝦對(duì)益生菌的有效攝入，從而體現(xiàn)出比拌服較好的效果。復(fù)合菌酶制劑的作用效果則表明了益生菌和酶制劑之間的協(xié)同作用可能對(duì)增強(qiáng)凡納濱對(duì)蝦的非特異性免疫能力具有更佳的效果。而固體發(fā)酵制劑組的效果則可能與多方面有關(guān)。一方面，固體發(fā)酵培養(yǎng)物中含有芽孢桿菌等益生菌，也含有多種微生物菌體營(yíng)養(yǎng)物以及發(fā)酵產(chǎn)生的復(fù)雜代謝產(chǎn)物，這些均可能更為有效地提高對(duì)蝦的機(jī)體免疫力；另一方面，相對(duì)于普通的高蛋白飼料(粗蛋白含量42%，C/N 6.4)，添加固體發(fā)酵物的飼料蛋白含量較低(粗蛋白含量36%)、C/N較高(7.4)，可能更有助于促進(jìn)腸道土著有益微生物的生長(zhǎng)繁殖，從而有效改善腸道的微生態(tài)環(huán)境和腸道功能，提高機(jī)體免疫力。當(dāng)然，鑒于發(fā)酵培養(yǎng)物成分組成非常復(fù)雜，關(guān)于這一功能制劑的作用機(jī)理尚需進(jìn)一步深入研究。

3.3 不同復(fù)合微生態(tài)制劑作用效果綜合比較

關(guān)于微生態(tài)制劑的作用機(jī)理，目前有很多不同解釋[34]。然而，由于微生態(tài)制劑組成、工藝等諸多方面存在的差異，不同的微生態(tài)制劑的實(shí)際作用機(jī)制可能更復(fù)雜。從本研究的結(jié)果看，與對(duì)照組相比，不同微生態(tài)制劑對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能改善程度的排序?yàn)楣腆w發(fā)酵制劑組>復(fù)合菌酶制劑組>后噴涂復(fù)合菌制劑組>拌服復(fù)合菌制劑組，基本上與其對(duì)蝦血清非特異性免疫酶活性提高效果是一致的。但副溶血弧菌攻毒的實(shí)驗(yàn)結(jié)果則存在一定的差異。副溶血弧菌是發(fā)現(xiàn)最早的對(duì)蝦EMS主要致病菌之一，被感染的對(duì)蝦可能出現(xiàn)紅腿病、紅體病和敗血癥等，發(fā)病迅速[35-36]。在本研究攻毒實(shí)驗(yàn)中，固體發(fā)酵制劑組對(duì)蝦對(duì)副溶血弧菌的抗病力最強(qiáng)，后噴涂復(fù)合菌制劑次之，再次為復(fù)合菌酶制劑組，但拌服復(fù)合菌制劑組則與對(duì)照組相比差異不大。綜合來(lái)看，固體發(fā)酵制劑組在各方面均顯示出了最佳的效果。

除了幾種復(fù)合微生態(tài)制劑在成分組成的差別，其添加形式和生產(chǎn)工藝存在的差異也值得關(guān)注。本研究設(shè)置的4種不同的微生態(tài)制劑，實(shí)際上不同程度涉及了微生態(tài)制劑在添加形式和生產(chǎn)工藝等方面存在的不同，也反映了目前微生態(tài)制劑行業(yè)在產(chǎn)品使用、設(shè)計(jì)思路和工藝路線上存在的諸多差異。拌服是微生態(tài)制劑最常見(jiàn)的使用方式，不僅麻煩，由于溶失嚴(yán)重，其效果也難以保證。本研究結(jié)果在一定程度上驗(yàn)證了這一缺陷。相比較，飼料生產(chǎn)后噴涂工藝則是一種添加微生態(tài)制劑的較好選擇。這種工藝過(guò)程規(guī)范，噴涂均勻，但對(duì)噴涂設(shè)備和干燥工藝要求相對(duì)較高。復(fù)合菌酶制劑在成分組成上具有較大的創(chuàng)新，使用上也比較方便，簡(jiǎn)單摻合混勻即可。其成分配伍、顆粒形狀、規(guī)格等完全模仿配合飼料，對(duì)蝦在攝食上也不存在明顯的差異。但由于采用低溫制粒工藝，對(duì)生產(chǎn)設(shè)備和工藝要求也較高。一般來(lái)講，由于益生菌和酶制劑等無(wú)法耐受對(duì)蝦飼料加工過(guò)程的高溫，因此無(wú)法直接添加在飼料原料中制粒。在本研究中，飼料中添加了以死亡微生物菌體和微生物發(fā)酵代謝產(chǎn)物為主的復(fù)合微生物發(fā)酵培養(yǎng)物，大大降低了飼料生產(chǎn)的工藝難度。從養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，不僅在較低的蛋白水平下獲得了較高生長(zhǎng)速率，而且對(duì)免疫和抗病能力的影響也最佳，甚至養(yǎng)殖水體的水質(zhì)也明顯改善(未發(fā)表數(shù)據(jù))。盡管這一功能飼料的作用機(jī)理尚需進(jìn)一步深入研究，但這一產(chǎn)品的配伍及生產(chǎn)工藝思路值得關(guān)注。

4 結(jié)論

飼料中合理添加復(fù)合菌制劑、復(fù)合菌酶制劑及復(fù)合菌培養(yǎng)物能有效促進(jìn)凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)，提高對(duì)蝦血清的非特異性免疫酶活性，增強(qiáng)對(duì)蝦對(duì)副溶血弧菌的抗病力?？傮w比較，后噴涂添加復(fù)合菌制劑、復(fù)合菌酶顆粒制劑效果優(yōu)于拌服復(fù)合菌制劑，而添加復(fù)合菌培養(yǎng)物的飼料效果最佳。