長牡蠣和巖牡蠣種間配子兼容性及合子育性分析*

徐洪強，李 琪，張景曉

(海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室(中國海洋大學)，山東 青島 266003)

長牡蠣 (Crassostreagigas)是中國主要海水貝類養(yǎng)殖品種，具有生長快，產(chǎn)量高的特點。為達到遺傳改良的目的，促進牡蠣養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展，近年來，牡蠣育種學家開展了多項選擇和雜交育種工作，如Li等[1]開展了長牡蠣中日韓三個地理群體的選育工作并培育出新品種“海大1號”；Zhang等[2]將長牡蠣與香港巨牡蠣的雜交子代與親代回交，通過選育回交子代培育出新品種“華南1號”。實踐證明科學的育種方法可以提高牡蠣的表型性狀，創(chuàng)造出巨大的經(jīng)濟及社會價值，而雜交育種作為一種傳統(tǒng)的育種手段，能夠結合雙親的優(yōu)良性狀，甚至產(chǎn)生某些雙親所沒有的性狀，創(chuàng)造出全新的變異類型[3]。

巖牡蠣(Crassostreanippona)自然分布于日本和韓國東南沿海，由于其味道鮮美，出肉率高，且殼形優(yōu)美，可夏季供應市場，經(jīng)濟價值十分可觀。巖牡蠣性成熟期是2～3 a[4]，相比長牡蠣生長速度較慢。長牡蠣和巖牡蠣同屬于巨蠣屬(Crassostrea)，存在互補性狀，若能進行種間雜交，有望培育出具有雜種優(yōu)勢的新品種。鑒于種間雜交技術難度高，容易出現(xiàn)配子不親和、雜交子代生長緩慢等問題[5]，因此需要對胚胎發(fā)育的早期性狀如配子兼容性、細胞遺傳學等進行研究，以探索利用種間雜交培育新品種的可行性。

配子不兼容是指來自一個個體的精子與另外一個個體的卵子不能完成受精作用[6]，屬于合子前生殖隔離[7]。配子兼容性是貝類種間雜交的重要研究內容之一，配子不兼容主要是與控制配子結合相關的基因發(fā)生變異所致，如控制結合素(Bindin)、細胞溶素(Lysin)等合成的基因[8]。學者們從受精細胞學方面研究了長牡蠣×熊本牡蠣(C.sikamea)[9]、巖牡蠣×長牡蠣[10]、櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)×蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)[11]、華貴櫛孔扇貝(Chlamysnobilis)×櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)[12]及紫貽貝(Mytilusedulis)×厚殼貽貝[13](M.coruscus)的早期胚胎發(fā)育；從受精及孵化方面研究了香港巨牡蠣(C.hongkongensis)×長牡蠣[14]、葡萄牙牡蠣(C.angulata)×熊本牡蠣[15]、紫扇貝(Argopectenpurpuratus)×海灣扇貝(A.irradiansirradians)[16]、海灣扇貝×蝦夷扇貝[17]的生殖隔離機制。而合子不育是指兩個物種的配子可以發(fā)生受精作用，但是受精后胚胎發(fā)育過程受阻的現(xiàn)象，屬于合子后生殖隔離[7]。合子育性水平也是種間雜交的重要研究內容之一，種間雜交生殖能力的減弱是由于減數(shù)分裂異常導致[18]，在貝類種間雜交中存在許多能夠受精卻無法進行胚胎發(fā)育的現(xiàn)象，對合子育性進行研究，是提高種間雜交成功率的重要前提。

本研究以配子兼容性作為合子受精前隔離指標，以合子育性作為合子受精后隔離指標，對長牡蠣和巖牡蠣生殖隔離格局進行探討，這對研究長牡蠣和巖牡蠣的種間雜交、物種形成與進化等都具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗親貝選用2015年構建的巖牡蠣養(yǎng)殖群體和2016年構建的長牡蠣“海大1號”群體。為解決巖牡蠣與長牡蠣性腺發(fā)育不同步的問題，將巖牡蠣置于萊州海益苗業(yè)有限公司20 m3水泥池進行室內催熟，促熟期間水溫27～31 ℃，鹽度29～32，至2017年7月下旬，巖牡蠣性腺發(fā)育成熟；7月初將性成熟的長牡蠣置于17～18 ℃冷水中抑制其排卵，海水溫度由循環(huán)式冷水機調控。

1.2 實驗設計

選擇對牡蠣受精孵化較為重要的3個指標(溫度、鹽度和精子濃度)來闡明長牡蠣和巖牡蠣種間配子兼容性與合子育性水平。綜合考慮長牡蠣和巖牡蠣的適應特點，設計5個溫度梯度(17、21、25、29和33 ℃)和5個鹽度梯度(18、22、26、30和34)，為保證實驗數(shù)據(jù)準確，每個交配組合設置3個生物學重復。選擇性腺飽滿的長牡蠣和巖牡蠣雌雄各5個個體，解剖性腺組織獲取精卵并將每個種類的5個個體卵子混合到一起，精子混合到一起，進行完全雙列雜交，得到4個交配組合：長牡蠣♀×長牡蠣♂(GG)、長牡蠣♀×巖牡蠣♂(GN)、巖牡蠣♀×長牡蠣♂(NG)、巖牡蠣♀×巖牡蠣♂(NN)。實驗于2 L水族箱中進行，卵子密度為30～ 40個/mL。溫度實驗中，利用循環(huán)式冷水機和加熱棒控制溫度，鹽度保持在29；鹽度實驗中，溫度保持在28 ℃。

精子密度是評估種間雜交配子兼容性的重要因素，并可能解釋受精障礙的進化機制[19]。參照Banks等[20]對貝類雜交配子兼容性格局的分析，設計5個精子濃度梯度(100、101、102、103和104個/μL)，其中精子通過血球計數(shù)板測定密度。溫度設置為28 ℃，鹽度設置為29。

1.3 數(shù)據(jù)處理

為保證方差齊性，受精率及孵化率均轉化為反正弦函數(shù)，精子濃度轉化為對數(shù)函數(shù)。實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，并結合Turkey多重比較分析溫度、鹽度對種間配子兼容性和合子育性的影響。顯著性水平設為P< 0.05。

2 結果

2.1 溫度對受精率和孵化率的影響

如圖1所示，GG組受精率受溫度影響較小，維持在78%～87%之間；NN組受精率隨溫度的升高先增大后降低，29 ℃時受精率最高，為82.8%；GN與NG組最適受精溫度為分別為21 和25 ℃，對應受精率分別是43.7%和42.8%。方差分析顯示，17～33 ℃時GG組受精率顯著高于2個雜交組(P< 0.05)；21～33 ℃時NN組顯著高于2個雜交組(P< 0.05)；在17～33 ℃之間時2個雜交組受精率無顯著性差異(P> 0.05)(見表1)。

圖1 溫度對配子兼容性和合子育性的影響Fig.1 Effect of temperature on gamete compatiblity and zygote fertility

表1 溫度對配子兼容性和合子育性影響的方差分析Table 1 Analysis of variance for the effect of temperature on gamete compatibility and zygote fertility

注：df表示自由度，MS表示均方，P表示P值；* 表示差異顯著(P< 0.05)，**表示差異極顯著(P< 0.01)；不同的字母表示差異顯著(P< 0.05)；下同。
Note: df，MS andPmean degree of freedom，square andPvalue respectively.* and * * denote significant (P< 0.05) and extremely significant (P< 0.01)，respectively.Data with different letters mean significant difference with each other (P< 0.05).The same as the following.

4個實驗組孵化率變化趨勢與受精率基本類似，GG、GN、NG和NN組孵化率最大值分別為76.9%、33.5%、33.4%和74.8%。方差分析表明，在17和21℃，GG與NN差異顯著(P< 0.05)，隨著溫度升高，兩自繁組孵化率差異不顯著(P> 0.05)；當溫度為17～33 ℃時，GG組孵化率顯著高于兩雜交組(P< 0.05)，在21～33 ℃之間時，NN組顯著高于兩雜交組(P< 0.05)；同受精率一樣，兩雜交組孵化率無顯著性差異(P> 0.05)(見表1)。方差分析結果表明，溫度是影響NN、NG、GN受精率和孵化率的主要因素，但對GG影響較小(見表2)。

2.2 鹽度對受精率和孵化率的影響

GG組受精率受鹽度影響較小，維持在76.9%～86.6%之間；NN組受精率隨鹽度的升高先增加后降低，最適鹽度為30，對應受精率為85.0%；GN組受精率在30時出現(xiàn)最大值，為31.6%，隨后隨鹽度的升高而降低；NG組在26時出現(xiàn)最大值41.2%，相比于NG組，GN組受鹽度影響小(見圖2)。方差分析顯示，GG和NN組受精率在鹽度18～22時差異顯著(P< 0.05)，在26～34之間差異不顯著(P> 0.05)，自繁組受精率顯著大于兩雜交組(P< 0.05)；GN和NG組受精率在18～34之間差異顯著(P< 0.05)(見表3)。

圖2 鹽度對配子兼容性和合子育性的影響Fig.2 Effect of salinity on gamete compatiblity and zygote fertility

表2 溫度、鹽度作用對配子親和力及合子育性的影響Table 2 Analyses of variance showing temperature and salinity effects for gamete compatibility and zygote fertility

注：T表示溫度效應，S表示鹽度效應，T×S表示溫度與鹽度的交互作用。
Note：T，SandT×Smean the effects of temperature，the effect of salinity and the interaction of temperature and salinity respectively.

4個實驗組孵化率變化趨勢與受精率基本一致，GG、GN、NG和NN組最大孵化率分別為77.3%、25.9%、37.7%和79.8%。 GG和NN組受精率在鹽度18～22時差異顯著(P< 0.05)，在26～34之間差異不顯著(P> 0.05)；在18～34，GG組與2個雜交組差異顯著(P< 0.05)；鹽度為18時，NN、GN和NG三組差異均不顯著；而鹽度為18、22、30和34時，GN與NG組差異不顯著(P< 0.05)。鹽度是影響NN、NG、GN組受精率和孵化率最主要因素，但是對長牡蠣影響不顯著(P> 0.05)。溫度和鹽度的交互作用對雜交組受精率和孵化率具有顯著影響(見表3)。

表3 鹽度對配子兼容性和合子育性影響的方差分析Table 3 Analysis of variance for the effect of salinity on gamete compatibility and zygote fertility

2.3 精子濃度

如圖3所示，自繁組的受精率和孵化率顯著高于2個雜交組(P< 0.05)；相比于其他3組，GG組受精率受精子濃度影響小，NN組受精率在精子濃度103個/μL時最大，為88.3%，其后隨精子濃度增加有減小趨勢；當精子濃度為100～ 104個/μL時，GN和NG兩組受精率隨精子濃度的增大而增大，最大受精率出現(xiàn)在104個/μL，分別是43.9%和46.2%，兩組之間受精率差異不顯著(P>0.05)。就孵化率而言，GG、GN、NG和NN組最大孵化率分別為76.1%、39.9%、44.2%和81.9%，2個自繁組在精子濃度100、101和102個/μL時差異顯著(P< 0.05)，但隨著精子濃度繼續(xù)升高，差異不顯著(P> 0.05)；兩雜交組孵化率在精子濃度100～ 104個/μL時差異不顯著(P> 0.05)(見表4)。

圖3 精子濃度對配子兼容性和合子育性的影響Fig.3 Effect of sperm concentration on gamete compatiblity and zygote fertility

表4 精子濃度對配子兼容性和合子育性影響的方差分析Table 4 Analysis of variance for the effect of sperm concentration on gamete compatibility and zygote fertility

3 討論

3.1 配子兼容性分析

配子兼容性水平與精子和卵子結合的能力密切相關，一般而言，配子不兼容表現(xiàn)為不完全受精并且經(jīng)常是單向受精[6]。本研究表明長牡蠣與巖牡蠣種間雜交是雙向受精，即產(chǎn)生正反交子代，但是種間雜交受精率較低，在最佳實驗條件下僅為40%～50%，遠遠低于自繁組受精率，也低于其他巨蠣屬種間雜交受精率，如長牡蠣♂×香港巨牡蠣♀(61.6%)[21]、香港巨牡蠣♂×熊本牡蠣(57.2%)[22]、熊本牡蠣♂×香港巨牡蠣♀(82.1%)[22]、葡萄牙牡蠣♂×香港巨牡蠣♀ (61.9%)[23]，這可能是由于巖牡蠣與長牡蠣親緣關系較遠造成遺傳差異大[24]，生殖細胞不能正常結合，從而表現(xiàn)出受精障礙。

溫度、鹽度和精子濃度對NN、NG和GN三組受精率具有顯著影響，但對GG組合受精率影響不顯著，表明長牡蠣對溫度和鹽度具有較強的耐受性，這與Gagnaire等[25]的結論一致。大量研究表明較高的精子濃度有助于提高種間雜交的受精率[18，26-27]，但是過高精子濃度會導致畸形率的增加，本研究雜交組受精率隨精子濃度增加呈現(xiàn)出遞增趨勢，均顯著低于自繁組，雜交組精子能夠游向卵子發(fā)生趨化作用，但是多數(shù)精子不能與異種卵子完成受精作用，配子識別蛋白的分化可能導致了兩物種受精的不完全兼容性[28]。在溫度實驗中雜交組最適溫度(GN組21 ℃，NG組25 ℃)相比于自繁組NN(29 ℃)偏低。鹽度實驗中，GG和NG組最適鹽度為26，GN和NN組最適鹽度為30，表現(xiàn)出適鹽性的父系遺傳趨勢，而在牡蠣遠緣雜交中，幼蟲表型性狀在前期一般會表現(xiàn)出強烈的母本效應[21]。這種適鹽性的父系遺傳是否會維持，有待于對稚貝及成貝進行進一步的研究。

3.2 合子育性分析

胚胎發(fā)育是檢驗合子育性的重要參考。由于種間雜交親本間存在生殖隔離，雜交子代可能會出現(xiàn)胚胎發(fā)育速度變化和畸形等現(xiàn)象[21]。對于海洋雙殼貝類而言，合子不育指精卵能夠發(fā)生受精作用但無法發(fā)育到D形幼蟲或發(fā)育至D形幼蟲無法繼續(xù)生長的現(xiàn)象[29]。本研究中，4個組孵化率在實驗條件下與受精率呈正相關，正反交子代均得到正常D形幼蟲，且雜交組幼蟲發(fā)育至D形幼蟲未觀察到明顯的延遲，說明長牡蠣與巖牡蠣雜交子孵化成敗的關鍵是受精過程，種間雜交子在孵化階段具有較好的合子育性，幼蟲及稚貝階段的生長發(fā)育情況有待于進一步觀察。

對于種間雜交而言，同一雜交組合在不同實驗環(huán)境條件下結果往往不同[29]。張躍環(huán)[21]在不同地點對香港巨牡蠣和長牡蠣種間雜交進行實驗，得到了顯著不同的幼蟲及稚貝數(shù)量?？紤]到本研究中實驗因素對種間受精率及孵化率具有顯著影響，在以后的實驗中，通過設置不同的外界環(huán)境條件來獲得更高受精率和孵化率的種間雜交子代是一條可行的途徑。

4 結語

本研究證明溫度、鹽度和精子濃度對長牡蠣和巖牡蠣種間配子兼容性和合子育性具有較大影響，并確定了長牡蠣和巖牡蠣雜交子孵化的最適溫度和鹽度：GN和NG組最適溫度分別為 21 和25 ℃，最適鹽度分別為 30和26。兩者能夠雙向受精且獲得正常D形幼蟲，至于合子后生殖隔離有待于進一步研究。本研究結果為進一步開展長牡蠣和巖牡蠣的種間雜交工作、研究兩者之間的進化關系提供了重要的基礎資料。