四磺化酞菁鋅與白蛋白復(fù)合物的制備、光譜性質(zhì)與光動(dòng)力活性研究

張麗娟，鄭碧遠(yuǎn)，李洪才，黃劍東*

(1.福建生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)系，福建 福州 350002；2.福州大學(xué) 化學(xué)學(xué)院，福建 福州 350116)

圖1 ZnPcPS4的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structure of ZnPcPS4

光動(dòng)力療法(Photodynamic therapy,PDT)作為一種新興的癌癥治療手段，因獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)而顯示出良好的臨床應(yīng)用前景[1-5]。酞菁因具有光敏化能力強(qiáng)、暗毒性低和易于結(jié)構(gòu)修飾等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用作新一代抗癌光敏劑[6-9]。研究發(fā)現(xiàn)，酞菁配合物雖光敏活性較強(qiáng)，但對(duì)腫瘤組織的選擇性和富集能力有限[10]。血清白蛋白是一種運(yùn)載蛋白，可與許多化合物結(jié)合，在體內(nèi)起到轉(zhuǎn)運(yùn)的作用，且對(duì)某些類(lèi)型的癌細(xì)胞具有一定的靶向作用[11]。因此，研究酞菁配合物與白蛋白的相互作用及兩者復(fù)合物的制備，對(duì)提高光敏劑的光敏活性和靶向性具有重要意義[12-14]。本課題組合成了具有光敏活性的1,8,15,22-四(4-磺酸基苯氧基)酞菁鋅四鈉鹽(記為ZnPcPS4，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1)[15]。本文重點(diǎn)研究了ZnPcPS4與白蛋白的相互作用，制備了兩者的非共價(jià)復(fù)合物，比較了復(fù)合前后光譜性質(zhì)的變化，并研究了復(fù)合物對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的光動(dòng)力抑制作用，以期為構(gòu)建具有靶向功能的酞菁基光敏劑提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

FL900/FS920型熒光光譜儀(英國(guó)Edinburgh公司)；UV-2450 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本Shimadzu公司)；TCS SPE熒光共聚焦顯微鏡(德國(guó)Leica公司)。

牛血清白蛋白(BSA)和人血清白蛋白(HSA)均為北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)公司產(chǎn)品；色譜柱所用填料為Sigma公司葡聚糖G-100凝膠；ZnPcPS4為本實(shí)驗(yàn)室合成，并經(jīng)核磁共振、質(zhì)譜和元素分析等表征確定。

1.2 磺化酞菁與白蛋白相互作用的光譜研究

1.2.1電子吸收光譜在室溫下，取2.0 mL PBS溶液于1 cm石英比色皿中，滴加8 μL濃度為2 mmol·L-1的磺化酞菁溶液(終濃度為8 μmol/L)，以PBS溶液為參比，對(duì)體系的電子吸收光譜進(jìn)行測(cè)定，然后在上述體系中滴加一定濃度梯度的白蛋白溶液，考察體系中的電子吸收光譜變化情況[16-17]。

1.2.2穩(wěn)態(tài)熒光光譜用移液器取2.0 mL白蛋白溶液于1 cm石英比色皿中，逐次滴加一定濃度的磺化酞菁溶液(累加體積小于220 μL，以減少體積變化引起的影響)，依次測(cè)定混合溶液中的蛋白質(zhì)熒光發(fā)射光譜，激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，掃描范圍為300～500 nm。記錄白蛋白的熒光強(qiáng)度隨酞菁濃度遞增的變化幅度，計(jì)算結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。

1.2.3相互作用常數(shù)根據(jù)文獻(xiàn)方法[18]，在靜態(tài)猝滅情況下，根據(jù)下式估算酞菁配合物與白蛋白的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。

其中，F(xiàn)0為不存在猝滅劑(指磺化酞菁配合物)時(shí)蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光強(qiáng)度，F(xiàn)為加入猝滅劑后的熒光強(qiáng)度，CQ為猝滅劑的濃度，KA為結(jié)合常數(shù)，n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。由線(xiàn)性關(guān)系作圖，通過(guò)直線(xiàn)的截距和斜率分別求出酞菁配合物與蛋白質(zhì)的結(jié)合常數(shù)KA和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n。

1.3 復(fù)合物制備

參照文獻(xiàn)方法[19]，通過(guò)溫育交換法制備磺化酞菁鋅與白蛋白的非共價(jià)復(fù)合物?；腔间\與白蛋白以一定的摩爾比在PBS緩沖溶液(pH 7.4)中混合均勻，于37 ℃下在氣浴搖床上溫育過(guò)夜后，通過(guò)G-100葡聚糖凝膠色譜分離純化，以PBS緩沖液為流動(dòng)相，由電子吸收光譜監(jiān)控洗脫成分，收集復(fù)合物對(duì)應(yīng)的洗脫組分，并通過(guò)冷凍干燥除去溶劑。復(fù)合物中白蛋白的含量通過(guò)考馬斯亮藍(lán)法(CBB法)測(cè)定，磺化酞菁含量則通過(guò)電子吸收光譜法測(cè)定(將其稀釋于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，通過(guò)Q帶的吸光度計(jì)算)。

1.4 離體光動(dòng)力抗癌活性

按文獻(xiàn)方法[20]，將復(fù)合物ZnPcPS4-BSA先用PBS溶解，配制成約80 μmol/L的母液，然后過(guò)0.22 μm濾膜；ZnPcPS4則先溶于DMF中配制成1 mmol/L溶液，用PBS稀釋至80 μmol/L，再用培養(yǎng)基稀釋至相應(yīng)的濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)法，檢測(cè)磺化酞菁及其白蛋白復(fù)合物的離體光動(dòng)力抗癌活性。

1.5 熒光成像法測(cè)試細(xì)胞攝取

圖2 ZnPcPS4電子吸收光譜隨BSA濃度的變化(A)及CBSA/CZnPcPS4比值與ZnPcPS4 Q帶最大吸收強(qiáng)度的關(guān)系(B)Fig.2 Change in electronic absorption spectra of ZnPcPS4 with BSA concentration(A)and Q band maximum absorbance insentity of ZnPcPS4 with CBSA/CZnPcPS4(B)CZnPcPS4=8.0 μmol/L；CBSA:0,0.87,1.75,2.61,3.48,4.34,5.21,6.08,6.95,7.82,8.69,17.38 μmol/L;PBS solution

圖3 ZnPcPS4對(duì)BSA熒光光譜的影響Fig.3 Change in fluorescence spectrum of BSA concentration with ZnPcPS4(excited at 280 nm)PBS buffer；insert：fitting curve of fluorescence quenching caused by ZnPcPS4；CBSA=20.4 μmol/L,CZnPcPS4=0,0.91,1.82,2.72,3.63,4.54,5.45,6.36,7.26,8.17,9.08 μmol/L

采用熒光共聚焦顯微鏡測(cè)試酞菁在細(xì)胞內(nèi)的熒光成像情況。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞接種于放置有潔凈無(wú)菌蓋玻片的培養(yǎng)板中，每板約1×105～2×105個(gè)細(xì)胞，在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后，棄去舊培養(yǎng)基，分別加入400 μL含磺化酞菁及其白蛋白復(fù)合物(2 μmol/L)的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，用PBS洗滌細(xì)胞2次，再用400 μL PBS覆蓋后進(jìn)行熒光共聚焦顯微鏡拍照。光敏劑用635 nm激發(fā)，收集645～750 nm的熒光。圖片用SPE ROI熒光分析軟件進(jìn)行處理，每個(gè)樣品計(jì)數(shù)20個(gè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果與討論

2.1 白蛋白對(duì)ZnPcPS4吸收光譜的影響

磺化酞菁ZnPcPS4在PBS溶液中存在單體和聚集體的平衡(圖2A)，表現(xiàn)在650 nm處有較強(qiáng)的聚集體吸收峰，692 nm處則為單體特征吸收峰。隨著B(niǎo)SA濃度的增大，酞菁的存在狀態(tài)由聚集體向單體轉(zhuǎn)化，說(shuō)明酞菁和BSA之間存在相互作用，而光敏劑以單體形式存在才能有效發(fā)揮其光敏活性。同時(shí)隨著B(niǎo)SA的加入，ZnPcPS4的Q帶最大吸收波長(zhǎng)從692 nm紅移至696 nm，光譜紅移有利于光動(dòng)力治療。

圖2B為酞菁ZnPcPS4在696 nm的吸收強(qiáng)度與CBSA/CZnPcPS4的關(guān)系圖。從圖中可見(jiàn)，當(dāng)CBSA/CZnPcPS4=1時(shí)，ZnPcPS4在696 nm的特征吸光度接近最大，當(dāng)濃度比大于1之后，隨著B(niǎo)SA的加入，酞菁的特征吸光度增加緩慢，說(shuō)明ZnPcPS4和BSA的非共價(jià)結(jié)合組成比可能為1∶1。另外，筆者發(fā)現(xiàn)，ZnPcPS4與HSA的相互作用和非共價(jià)結(jié)合比，均與ZnPcPS4和BSA類(lèi)似。這說(shuō)明可以用來(lái)源豐富且價(jià)格較低的BSA代替HSA，模擬酞菁與白蛋白的相互作用。

2.2 ZnPcPS4對(duì)白蛋白熒光光譜的影響

考察了酞菁ZnPcPS4對(duì)BSA內(nèi)源熒光的影響。結(jié)果顯示，在ZnPcPS4逐滴加入BSA溶液的過(guò)程中，BSA在340 nm的特征熒光強(qiáng)度呈規(guī)律性的減弱(見(jiàn)圖3)，這說(shuō)明酞菁對(duì)BSA有一定的猝滅作用。BSA的最大熒光發(fā)射峰波長(zhǎng)均發(fā)生藍(lán)移，特征熒光峰的位置和強(qiáng)度發(fā)生了明顯變化，表明ZnPcPS4與BSA之間存在較強(qiáng)的相互作用。實(shí)驗(yàn)考察表明，ZnPcPS4對(duì)HSA內(nèi)源熒光的影響與BSA類(lèi)似。

按照靜態(tài)猝滅公式lg[(F0-F)/F]=lgKA+nlgCQ，對(duì)ZnPcPS4猝滅白蛋白熒光數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，結(jié)果見(jiàn)圖3插圖。分別通過(guò)直線(xiàn)的截距和斜率，求出ZnPcPS4與白蛋白相互作用的結(jié)合常數(shù)KA和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n。ZnPcPS4與BSA的結(jié)合常數(shù)為6.72×106L/mol，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為1.30；ZnPcPS4與HSA的結(jié)合常數(shù)為4.36×106L/mol，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為1.30。KA值均較大，說(shuō)明ZnPcPS4與白蛋白之間存在較強(qiáng)的相互作用。

近年來(lái)本課題組合成的酞菁鋅與白蛋白的非共價(jià)結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)見(jiàn)表1[21-22]。由表1可見(jiàn)，ZnPcPS4與兩種白蛋白的結(jié)合能力最強(qiáng)，磺化酞菁與白蛋白的相互作用顯著。十六羧基酞菁鋅ZnPc(COOH)16比單羧基酞菁鋅ZnPcC1的結(jié)合常數(shù)大，其與白蛋白的相互作用強(qiáng)于單羧基酞菁鋅。結(jié)果表明，酞菁環(huán)上取代基的結(jié)構(gòu)和數(shù)目對(duì)酞菁與白蛋白的相互作用能力有顯著影響。

表1 酞菁和BSA(HSA)的結(jié)合參數(shù)Table 1 The parameters of complexes binding to BSA and HSA

2.3 ZnPcPS4在白蛋白中的結(jié)合位點(diǎn)

參照文獻(xiàn)方法[23],應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)點(diǎn)位標(biāo)記置換法研究了酞菁與白蛋白相互作用的結(jié)合位點(diǎn)。分別用氯化血紅素(Hemin)、水楊酸鈉(NaA)及布洛芬(ⅠB)作為蛋白質(zhì)亞域ⅠB、亞域ⅡA(位點(diǎn)Ⅰ)和亞域ⅢA(位點(diǎn)Ⅱ)的競(jìng)爭(zhēng)位點(diǎn)標(biāo)記物。如圖4所示，ZnPcPS4在PBS中的熒光強(qiáng)度較弱，而B(niǎo)SA的加入促使酞菁聚集體向單體轉(zhuǎn)化，熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。但將Hemin加至ZnPcPS4-BSA體系后，熒光強(qiáng)度大幅降低，在相同條件下，水楊酸鈉和布洛芬則對(duì)ZnPcPS4-BSA體系的熒光光譜無(wú)影響。采用電子吸收光譜測(cè)定，也得到類(lèi)似結(jié)果。這表明Hemin置換了與BSA結(jié)合的ZnPcPS4，即ZnPcPS4和BSA相互作用的結(jié)合位點(diǎn)主要為亞域ⅠB。

2.4 ZnPcPS4與白蛋白復(fù)合物的制備

以摩爾比約為4∶1將ZnPcPS4和牛血清白蛋白均勻混合，通過(guò)溫育交換法制備復(fù)合物。圖5為復(fù)合物ZnPcPS4-BSA在凝膠色譜中的分離洗脫曲線(xiàn)。其中，洗脫體積為12～18 mL時(shí)洗脫液呈綠色的組分既有696 nm的酞菁特征吸收峰，又有340 nm的白蛋白特征熒光發(fā)射峰，應(yīng)為酞菁-白蛋白非共價(jià)復(fù)合物。采用相同方法制備ZnPcPS4-HSA復(fù)合物，其洗脫體積13～18 mL的餾分為復(fù)合物。

圖5 ZnPcPS4-BSA復(fù)合物的流出曲線(xiàn)Fig.5 Elution profiles of ZnPcPS4-BSA conjugate as monitored absorbance at 696 nm and fluorescence emission at 340 nm upon excitation at 280 nm

圖6 ZnPcPS4(A) 和ZnPcPS4-BSA(B)對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的細(xì)胞毒性Fig.6 Cytotoxic effects of ZnPcPS4(A) and ZnPcPS4-BSA(B) conjugates on HepG2 cells

對(duì)于分離純化后的非共價(jià)復(fù)合物，分別通過(guò)電子吸收光譜和考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定酞菁ZnPcPS4和白蛋白的含量，求得復(fù)合物中酞菁和白蛋白的摩爾比約為1∶1。

2.5 復(fù)合物的光譜性質(zhì)

以復(fù)合物 ZnPcPS4-BSA為例，比較了復(fù)合物ZnPcPS4-BSA(11.0 μmol/L)與游離ZnPcPS4(11.0 μmol/L)在PBS緩沖液中的電子吸收光譜。與游離的酞菁相比，復(fù)合物中酞菁的Q帶吸收峰較強(qiáng)且相對(duì)尖銳，說(shuō)明在復(fù)合物中酞菁主要以單體形式存在，聚集程度降低。ZnPcPS4-BSA的Q帶吸收波長(zhǎng)發(fā)生紅移(從692 nm紅移至696 nm)，原因可能是酞菁和白蛋白相互作用，使酞菁環(huán)之間的π-π堆積程度降低，從而使酞菁部分解聚，單體酞菁含量增高。另外，由于波長(zhǎng)越長(zhǎng)的光越能夠更好地穿透人體組織，因此光譜紅移有益于光動(dòng)力治療。

2.6 離體抗癌活性研究

進(jìn)一步比較了復(fù)合物ZnPcPS4-BSA和其對(duì)應(yīng)的游離ZnPcPS4對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的光動(dòng)力抑制作用(圖6)。在測(cè)試濃度內(nèi)，化合物對(duì)HepG2細(xì)胞均無(wú)暗毒性，而在光照條件下，均對(duì)HepG2細(xì)胞具有明顯的生長(zhǎng)抑制作用，且抑制作用呈濃度依賴(lài)性。表明該化合物無(wú)化療作用，只有在光激發(fā)下才產(chǎn)生毒性殺死癌細(xì)胞，采用特定波長(zhǎng)的激光照射腫瘤組織，可靶向殺死癌細(xì)胞，減少副作用。復(fù)合物ZnPcPS4-BSA的IC50值僅為1.68 μmol/L，活性明顯高于其對(duì)應(yīng)的游離ZnPcPS4(IC50=2.73 μmol/L)。這說(shuō)明復(fù)合物的抗癌活性比其對(duì)應(yīng)的游離酞菁強(qiáng)。

為進(jìn)一步研究導(dǎo)致ZnPcPS4 和ZnPcPS4-BSA抗癌活性出現(xiàn)明顯差異的原因，利用熒光共聚焦顯微鏡研究了其細(xì)胞攝取。如圖7所示，ZnPcPS4-BSA在細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于其對(duì)應(yīng)的游離ZnPcPS4，為后者的4.4倍。由于ZnPcPS4-BSA在生理?xiàng)l件下的Q帶最大吸收強(qiáng)度僅比ZnPcPS4略大(增大不足2倍)，因此它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度的4.4倍差別也反映了其細(xì)胞攝取差異，即ZnPcPS4-BSA復(fù)合物被肝癌細(xì)胞攝取的能力明顯高于單純的ZnPcPS4，這可能是因?yàn)榘椎鞍卓赏ㄟ^(guò)癌細(xì)胞表面受體進(jìn)行主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)。因此，復(fù)合物ZnPcPS4-BSA相比于游離ZnPcPS4具有較高的光動(dòng)力抗癌活性，可歸因于其具有更高的癌細(xì)胞攝取率。

3 結(jié) 論

本文通過(guò)電子吸收光譜和熒光光譜研究了α位四磺化酞菁鋅ZnPcPS4與白蛋白的相互作用。結(jié)果表明，ZnPcPS4和白蛋白之間存在較強(qiáng)的相互作用，結(jié)合常數(shù)為106數(shù)量級(jí)，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為1.30，白蛋白可使ZnPcPS4的聚集體向單體轉(zhuǎn)化。并通過(guò)溫育交換法制備了ZnPcPS4和白蛋白的摩爾比約為1∶1的ZnPcPS4-BSA和ZnPcPS4-HSA復(fù)合物。光譜研究表明，ZnPcPS4與白蛋白復(fù)合后展現(xiàn)出比游離ZnPcPS4更明顯的單體特征吸收峰，復(fù)合物的Q帶最大吸收波長(zhǎng)紅移，這將有利于光動(dòng)力治療作用。復(fù)合物ZnPcPS4-BSA對(duì)HepG2細(xì)胞的光動(dòng)力抑制效應(yīng)結(jié)果表明，復(fù)合物ZnPcPS4-BSA的IC50值為1.68 μmol/L，活性明顯高于其對(duì)應(yīng)的游離ZnPcPS4，這可能是由于白蛋白對(duì)某些癌細(xì)胞的靶向性，使得復(fù)合物具有更高的癌細(xì)胞攝取率。研究表明該類(lèi)復(fù)合物有望發(fā)展為具有靶向功能的抗癌光敏劑，為新型靶向抗癌光敏劑的開(kāi)發(fā)提供有益參考。