環(huán)境脅迫植物富集γ-氨基丁酸的研究進(jìn)展

王 斌,丁俊胄,2,賈才華,*,趙思明,*,牛 猛,張賓佳,熊善柏,林親錄

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖北武漢 430070;2.伊利諾伊大學(xué)香檳分校食品與人類營(yíng)養(yǎng)學(xué)系,美國(guó)伊利諾伊州厄巴納市 61801;3.中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,湖南長(zhǎng)沙 410004)

γ-氨基丁酸(Gama-aminobutyric acid,GABA)是一種四碳非蛋白組成氨基酸,在神經(jīng)系統(tǒng)中是一種重要的神經(jīng)活性抑制劑,具有諸多功效,例如降低血壓、治療失眠、緩解焦慮、增強(qiáng)免疫力以及增加記憶力等作用[1]。我國(guó)衛(wèi)生部2009年批準(zhǔn)γ-氨基丁酸為新資源食品,建議成人每天攝入500 mg以內(nèi)。隨著人們年齡的增長(zhǎng),人體通過(guò)自身代謝生成GABA的能力降低,加之日常飲食中GABA含量攝入量不夠,人體GABA含量較低。

GABA廣泛分布于植物中,但含量普遍較低,當(dāng)植物受到環(huán)境(低氧、低溫、熱、鹽滲透、機(jī)械損傷)刺激時(shí),會(huì)大量生成GABA。在食品生產(chǎn)中,可通過(guò)改變外界環(huán)境刺激植物組織,促進(jìn)GABA的合成,制得高GABA食品,如茶葉、發(fā)芽糙米、豆芽等。

高GABA食品能夠有效增加人體GABA含量,對(duì)于保持人體健康具有重要意義。本文將從GABA的代謝機(jī)制、環(huán)境脅迫對(duì)GABA積累的影響以及幾種脅迫方式在高GABA食品研發(fā)中的應(yīng)用做一個(gè)綜述。

1 γ-氨基丁酸代謝途徑

高等植物代謝積累GABA有兩種途徑。一種是以谷氨酸(L-Glutamine,Glu)作為底物,經(jīng)谷氨酸脫羧酶(Glutamate decarboxylase,GAD,EC 4.1.1.15)催化生成GABA,該途徑被稱為GABA旁路或GABA支路[2]。另一種則是以多胺(polyamines)為底物,經(jīng)過(guò)二胺氧化酶(DAO)、多胺氧化酶(PAO)催化,可將多胺(腐胺、亞精胺)轉(zhuǎn)化為GABA,該途徑被稱為多胺降解[3-4]。

1.1 GABA支路

GABA支路廣泛分布于真核生物和原核生物中,是GABA重要的代謝途徑。如圖1所示[1],在細(xì)胞質(zhì)中,谷氨酸首先被GAD催化不可逆生成GABA,隨后GABA由GABA轉(zhuǎn)氨酶(GABA transaminase,GABA-T)催化轉(zhuǎn)化為成琥珀酸半醛半醛酸(Succinic acid,SSA),琥珀酸半醛進(jìn)入線粒體,由琥珀酸半醛脫氫酶(Succinate-Semialdehyde Dehydrogenase,SSADH)氧化生成琥珀酸(Succinic acid,SSC),隨后琥珀酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)[2]。

圖1 GABA支路代謝路徑圖Fig.1 GABA shunt and its relationship to other metabolic pathways

1.2 多胺降解

多胺降解也是生成GABA的途徑之一。相較于GABA支路,多胺降解產(chǎn)生的GABA含量較少,在以往的研究中,大部分都是以GAD活性作為關(guān)鍵因素來(lái)探究GABA在植物體內(nèi)代謝情況。但最近的研究發(fā)現(xiàn),在某些植物中多胺的含量與GABA含量有密切聯(lián)系,通過(guò)多胺降解產(chǎn)生的GABA占有較大比例。Yang等[5]用氨基胍對(duì)大豆進(jìn)行處理發(fā)現(xiàn),氨基胍能顯著增加多胺含量,但GABA含量下降了30%。另外,Wang等[6]用外源GABA處理甜瓜根,發(fā)現(xiàn)處理后甜瓜根的多胺含量顯著增加,說(shuō)明多胺代謝與GABA代謝有密切聯(lián)系。

多胺降解產(chǎn)生GABA路徑如圖2所示,谷氨酸(L-Glutamic acid,L-Glu)經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)氨酶生成鳥(niǎo)氨酸(Ornithine,Orn)和精氨酸(Arginine,Arg),鳥(niǎo)氨酸和精氨酸經(jīng)過(guò)鳥(niǎo)氨酸氧化酶(Ornithine decarboxylase,ODC)和精氨酸氧化酶(Arginine decarboxylase,ADC)氧化生成腐胺(Putrescine,Put),隨后腐胺經(jīng)亞精胺合成酶催化轉(zhuǎn)化成亞精胺(Spermidine,Spd),亞精胺進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為精胺(Spermine,Spm)。腐胺和亞精胺分別經(jīng)二胺氧化酶(Diamine oxidase,DAO,EC 1.4.3.6)和多胺氧化酶(Polyamine oxidase,PAO,EC 1.5.3.3)氧化生成4-氨基丁醛,最后由氨基丁醛脫氫酶(4-aminobutyraldehyde dehydrogenase,ABALDH)轉(zhuǎn)化為GABA[4,7-8]。

圖2 多胺降解生成GABA代謝路徑Fig.2 The production of GABA through polyamine degradation

1.3 環(huán)境脅迫促進(jìn)GABA富集機(jī)理

當(dāng)外界環(huán)境發(fā)生改變,不利于植物生長(zhǎng)時(shí),會(huì)激發(fā)植物內(nèi)源酶活性,進(jìn)而大量產(chǎn)生GABA,從而使植物適應(yīng)外界的變化。GABA對(duì)于植物在逆境環(huán)境下的生存具有重要意義。

GABA在植物體內(nèi)主要有以下作用:a、調(diào)節(jié)pH,當(dāng)植物在無(wú)氧或受到機(jī)械損傷時(shí),細(xì)胞質(zhì)內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的H+,從而導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)酸中毒,GAD在代謝的過(guò)程中需要消耗H+,減緩酸中毒,從而起到調(diào)節(jié)pH的作用[9];b、氮素儲(chǔ)藏,GABA代謝的過(guò)程中會(huì)消耗大量的谷氨酸,谷氨酸中的氮素被臨時(shí)轉(zhuǎn)移到GABA,通過(guò)GABA支路代謝,氮素被重新用于蛋白合成[10];c、抵御干旱:GABA會(huì)使植物氣孔減小,從而減少水分的流失,進(jìn)而具有更強(qiáng)的抗旱能力[11];d、防止蟲害,當(dāng)受到蟲害時(shí),植物液泡中的有機(jī)酸被釋放從而激發(fā)GAD的活性,促進(jìn)GABA的產(chǎn)生,研究發(fā)現(xiàn)一定量GABA能夠減緩幼蟲的成長(zhǎng)發(fā)育、降低其存活率[12-13];e、抵抗霉變,經(jīng)GABA處理后的果實(shí),其抗霉變相關(guān)的酶的基因表達(dá)及活性會(huì)增強(qiáng),提高果實(shí)的抗霉能力[14]。

1.3.1 GABA支路 GAD是GABA支路代謝的限速酶,其活性與不同物種來(lái)源、環(huán)境條件差異等有密切聯(lián)系[15-16]。GAD的活性主要由pH和鈣離子/鈣調(diào)蛋白(CAM)結(jié)合調(diào)控[17]。在受到環(huán)境刺激時(shí)(低氧、低溫、酸刺激、高鹽滲透等),植物體內(nèi)H+和Ca2+會(huì)大量增加,H+和Ca2+對(duì)于GAD的活性均有促進(jìn)作用。大部分GAD在酸性環(huán)境下具有較大活性,只有少部分GAD在堿性環(huán)境下能保持較大活性,微生物GAD的最適pH一般在3.8左右[18],而植物GAD的最適pH則在5.8左右[19]。

Ca2+也是影響GAD活性的重要因素,GAD是一種鈣調(diào)素協(xié)調(diào)蛋白,含有CAM結(jié)合蛋白,能夠與Ca2+結(jié)合形成Ca2+/CAM。GAD的氨基酸組成中C端含有22～25個(gè)氨基酸殘基,形成的空間結(jié)構(gòu)能夠與Ca2+/CAM結(jié)合,起到激活GAD的作用[20],進(jìn)而促進(jìn)GABA的合成。但Ca2+僅在與CAM共同作用下才會(huì)激發(fā)GAD的活性。植物組織受到外界刺激(冷激、熱激、機(jī)械損傷、滲透壓脅迫等)時(shí),細(xì)胞質(zhì)中的Ca2+會(huì)大量增加,激活GAD,促進(jìn)GABA合成。

1.3.2 多胺降解 多胺降解生成GABA的代謝酶包括ADC、ODC、DAO、PAO以及ABALDH等[21-22]。多胺降解生成GABA的過(guò)程可以分為兩個(gè)步驟:多胺的生成和多胺的降解。多胺的生成主要由ADC和ODC來(lái)調(diào)控。ADC能催化精氨酸生成鯡精氨,進(jìn)而轉(zhuǎn)化為腐胺。ADC在植物界中分布廣泛,已發(fā)現(xiàn)的編碼基因有ADC1和ADC2[23]。ADC在所有的植物組織中均有表達(dá),在受到冷激作用下會(huì)促進(jìn)ADC1的表達(dá),而ADC2僅在植物組織受到外界刺激(冷凍、干燥、高鹽滲透、機(jī)械損傷等)時(shí),會(huì)促進(jìn)其表達(dá)[3]。ODC是一種磷酸吡哆醛依賴酶,能夠直接催化鳥(niǎo)氨酸生成腐胺,主要分布于動(dòng)物組織內(nèi),在植物中表達(dá)程度較低,合成的基因有ODC1和ODC2,其中ODC2僅存在于人體。ODC在逆境脅迫下活性變化較小,其主要在細(xì)胞分裂及發(fā)育的過(guò)程中發(fā)揮作用[24]。受到外界刺激時(shí),會(huì)促進(jìn)ADC和ODC的表達(dá),提高ADC和ODC的活性,進(jìn)而促進(jìn)多胺的積累[25]。

多胺的降解主要受到PAO和DAO的調(diào)控。DAO和PAO可分別將腐胺和亞精胺轉(zhuǎn)化為氨基丁醛,然后經(jīng)ABALDH催化生成GABA[4]。通常,DAO在植物體內(nèi)的表達(dá)程度較低,但是當(dāng)受到外界環(huán)境刺激時(shí)會(huì)促進(jìn)DAO的表達(dá)增加其活性,將積累的多胺轉(zhuǎn)化為GABA[25]。

2 環(huán)境脅迫處理在富集GABA中的應(yīng)用

2.1 低氧脅迫

低氧條件下,GABA被認(rèn)為是一種信號(hào)分子,能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)pH,抵抗氧化性損傷[26-27]。低氧是脅迫植物富集GABA最常用的手段之一,具有操作簡(jiǎn)單、成本低、效果明顯等優(yōu)勢(shì),在植物富集GABA中有廣泛的應(yīng)用。針對(duì)不同原材料,低氧處理方式獲得GABA含量雖有較大的差異,但較未處理組,GABA含量可提高5～30倍不等。楊潤(rùn)強(qiáng)等[28]先用pH3.5的營(yíng)養(yǎng)液浸泡蠶豆培養(yǎng)36 h,隨后低氧聯(lián)合NaCl脅迫培養(yǎng)4 d,蠶豆GABA含量可達(dá)1.06 mg/g(Dw),較空白GABA提高了7.57倍。尹永祺等[29]以玉米為原材料,在通氣量為1.0 L/min的條件下,脅迫培養(yǎng)3 d,GABA含量提高了12.2倍。黃亞輝等[30]分別用液體浸泡和真空充氮的方式脅迫茶葉富集GABA,茶葉的GABA含量分別達(dá)到4.01 mg/g和2.88 mg/g,提高了14倍和30倍。除了營(yíng)養(yǎng)液的方式進(jìn)行低氧脅迫,丁俊胄等[31]用CO2和N2真空充氣的方式對(duì)糙米進(jìn)行低氧脅迫,發(fā)現(xiàn)CO2的脅迫效果要優(yōu)于N2,且脅迫介入的時(shí)期及時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)富集GABA的效果也有顯著差異。Ding等[32]在使用“黑糯”和“先恢”兩個(gè)高GABA水稻親本研究中,發(fā)現(xiàn)常規(guī)發(fā)芽72 h后GABA含量是未發(fā)芽的2.8倍和6.4倍,而在66～72 h期間經(jīng)CO2低氧處理后的樣本GABA含量分別是未發(fā)芽糙米的38.5倍和37.6倍。

以往大部分的研究認(rèn)為,低氧脅迫下,植物主要是通過(guò) GABA支路的方式富集。植物在低氧脅迫下,細(xì)胞質(zhì)中的H+大量增加,促進(jìn)了GAD的代謝轉(zhuǎn)化。尹永祺等[33]以發(fā)芽玉米為實(shí)驗(yàn)材料,檢測(cè)低氧脅迫下玉米發(fā)芽過(guò)程中GAD、DAO、AMADH的活性,發(fā)現(xiàn)發(fā)芽過(guò)程,GAD活性先上升后下降,始終高于對(duì)照組,而DAO總體呈下降趨勢(shì),AMADH呈穩(wěn)定趨勢(shì)。玉米發(fā)芽過(guò)程中,多胺降解酶始終處于較低的活性,而GAD則處于較高的活性,表明在該過(guò)程中是GABA支路起主要作用。但最近的研究發(fā)現(xiàn)由多胺代謝所產(chǎn)生的GABA占了相當(dāng)大的比例,氨基胍對(duì)多胺氧化酶有特異性抑制作用,郭元新等[34]在低氧脅迫下用2.5 mmol的氨基胍抑制大豆中DAO的活性,而對(duì)GAD等酶無(wú)抑制作用,其富集GABA的含量降低了32%,說(shuō)明大豆富集的GABA中有32%來(lái)自于多胺降解。

2.2 高鹽滲透

高鹽滲透也是富集GABA的手段之一,植物組織在培養(yǎng)的過(guò)程中添加高濃度鹽溶液,可以促進(jìn)植物富集GABA。NaCl是高鹽脅迫中常用的脅迫劑。鹽脅迫的研究主要集中在高鹽對(duì)GABA支路的影響。鹽脅迫能夠提高植物體內(nèi)GAD的活性,曾晴等[35]用不同濃度的NaCl處理大豆,發(fā)現(xiàn)高鹽滲透條件下,GAD活性和GABA含量都隨著NaCl濃度的增加而升高,當(dāng)NaCl濃度為100 mmol/L,GABA含量可達(dá)269.93 mg/100 g。同時(shí),鹽脅迫作用在玉米、糙米,苦蕎等植物中也能起到類似的促進(jìn)作用[36-39]。鹽脅迫除了能提高GABA支路的積累量,對(duì)一些植物的多胺降解途徑也有一定程度的提高,Xing等[40]以大豆為原材料,通過(guò)鹽脅迫處理,發(fā)現(xiàn)隨著NaCl濃度的提高,DAO的活性增強(qiáng),多胺(Put、Spd和Spm)含量降低,GABA含量提高了17倍。

2.3 低溫脅迫

低溫脅迫是指在較低的溫度下儲(chǔ)藏處理植物,在該過(guò)程中會(huì)增加植物組織中GABA的含量。植物為了增強(qiáng)其抗凍能力,通過(guò)GABA支路提供能量,減少活性氧積累[27]。低溫脅迫是一種操作簡(jiǎn)單、高效的處理方式,一般不會(huì)單獨(dú)使用,會(huì)在植物種子發(fā)芽前后或聯(lián)合其他脅迫方式共同使用。馬麗等[41]采用低溫脅迫后的糙米進(jìn)行發(fā)芽實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示經(jīng)低溫脅迫后的發(fā)芽糙米GABA含量高,為原材料(未冷凍處理未發(fā)芽組別)的2.58倍,是發(fā)芽組(未冷凍處理)的1.19倍。白青云等[42]將馬鈴薯用營(yíng)養(yǎng)液浸泡后,用-24 ℃和-68 ℃冷凍,隨后微波解凍,結(jié)果顯示-24 ℃處理要比-68 ℃處理GABA含量更高,GABA含量可達(dá)51.37 mg/100 g,為原材料5.61倍。低溫脅迫與其他脅迫方式聯(lián)用可以進(jìn)一步增加植物中GABA的含量,尹永祺等[43]將低氧處理后的發(fā)芽玉米,分別置于5、-5、-18 ℃進(jìn)行低溫脅迫處理,解凍4 h后測(cè)定GABA含量,發(fā)現(xiàn)在-18 ℃條件下GABA含量最高,約為原材料(未低氧未低溫脅迫處理)GABA含量的30倍,同時(shí)較、單一低氧處理GABA含量提高36%。Wang等[44]用NO處理冷藏香蕉,發(fā)現(xiàn)低溫儲(chǔ)藏條件下,NO可以增加DAO酶活性同時(shí)降低GABA-T活性,促進(jìn)GABA的積累。綜上,低溫脅迫對(duì)兩種代謝途徑均有作用,可通過(guò)增加GAD活性、DAO活性或降低GABA-T活性等方式促進(jìn)植物中GABA的積累。

2.4 超聲波脅迫

超聲波技術(shù)常用于提取植物天然活性成分,提高植物種子發(fā)芽率,食品的清洗滅菌等。鄭藝梅等[45]采用28、40 kHz的超聲波分別處理發(fā)芽糙米,能夠顯著提高其GABA含量,約為原材料的3倍。Yang等[46]報(bào)道了浸泡過(guò)程中超聲波處理可提高黃豆芽中的GABA含量,使用頻率為40 kHz、功率300 W超聲波處理30 min的樣品組GABA含量比對(duì)照組高出43.39%。張祎等[47]報(bào)道了在糙米發(fā)芽17 h時(shí)采用頻率30 kHz的超聲波處理16 min,GABA含量達(dá)到77.56 mg/100 g。Ding等[48]研究25 kHz超聲波處理不同發(fā)芽時(shí)段糙米中GABA積累量,發(fā)現(xiàn)發(fā)芽時(shí)間0、66 h的糙米,經(jīng)5 min超聲處理后均可顯著提高GABA含量,分別較未超聲處理組提高60.87%和69.24%。

2.5 其他脅迫方式

除了低氧、高鹽、低溫等脅迫方式,其他方式如高溫?zé)峒?、酸性刺激等處理方式均能有效增加植物GABA的含量。Young-Su Youn等[49]采用低氧聯(lián)用熱處理方式,低氧處理后經(jīng)120 ℃處理30 s,脅迫兩種小麥發(fā)芽富集GABA,結(jié)果表明聯(lián)用脅迫方式處理的,兩種小麥GABA含量較、單一低氧處理組分別提高了1.82 mg/100 g和2.23 mg/100 g。Li等[50]采用弱酸性電解水處理粟谷發(fā)芽,結(jié)果顯示弱酸性電解水可促進(jìn)粟谷GABA積累,較原材料GABA含量提高21%。Hyun Soo Kim等[51]采用低氧、酸刺激等方法聯(lián)用處理糙米、米糠,均可以促進(jìn)GABA的合成,相較未處理組,GABA含量提高了17倍,達(dá)523 mg/100 g。

3 結(jié)論

GABA支路和多胺降解均是植物GABA代謝的重要途徑,對(duì)植物在環(huán)境脅迫下生長(zhǎng)起著至關(guān)重要的作用。與GABA支路途徑相比,多胺降解途徑生成的GABA含量雖然較低,但對(duì)于植物在環(huán)境脅迫條件下積累GABA研究具有重要意義。此外,不同脅迫方式對(duì)植物GABA含量及代謝機(jī)制均有較大差異,研究不同脅迫方式對(duì)植物積累GABA的影響,可用于研發(fā)高GABA食品。聯(lián)用不同脅迫方式可進(jìn)一步促進(jìn)GABA積累,但其涉及的不同代謝途徑及其相互作用機(jī)理尚不明確,有待進(jìn)一步研究。