車前草粗多糖對環(huán)磷酰胺所致免疫低下小鼠的免疫增強作用

董 升,梁晗業(yè),王禹捷,王俊剛,關曉嬌,姚月保,徐志立

(遼寧中醫(yī)藥大學藥學院,遼寧大連 116600)

車前草為車前科植物車前(PlantagoasiaticaL.)或平車前(PlantagodepressaWilld.)的干燥全草,具有清熱、利尿、通淋、祛痰、涼血、解毒等功效,多內(nèi)服或鮮草搗爛外敷,用于熱淋澀痛、水腫尿少、暑濕泄瀉、痰熱咳嗽、吐血衄血、癰腫瘡毒等病癥[1-2]。研究表明,車前草主要活性成分有黃酮類、苯乙醇苷類、環(huán)烯醚萜類、揮發(fā)油、多糖、膳食纖維等[3],具有利尿、鎮(zhèn)咳、祛痰、抗炎、緩瀉等作用[4]。

車前草多糖是車前草含有的主要活性成分之一,車前草多糖含有α-半乳糖(rhamnogalacturonans)、半乳糖(galactans)、阿拉伯半乳糖(arabinogalactans)及木聚半乳糖(xylogalacturonans)等成分[5]。許多植物多糖具有免疫調(diào)節(jié)作用[6],研究表明，車前草多糖能顯著提高雛雞抗體效價,促進淋巴細胞增殖,提高雛雞胸腺、脾臟和法氏囊等免疫器官的臟器指數(shù)[7-8];體外細胞培養(yǎng)結果顯示，車前草多糖可明顯提高細胞免疫能力及抗氧化活性[9-11]。

機體免疫系統(tǒng)主要有三大功能:免疫防御、免疫監(jiān)視和免疫自穩(wěn)定。免疫抑制會導致機體防御、識別與清除外來抗原(病原微生物等)和自身抗原的能力下降,難以維持機體生理平衡,導致疾病產(chǎn)生。盡管已有車前草多糖調(diào)節(jié)免疫功能的研究報道,但仍缺乏對于病理狀態(tài)動物的整體研究,尤其是對于免疫功能低下動物的緩解治療作用的研究。

環(huán)磷酰胺是一種細胞毒性藥物,能殺死有絲分裂和進入循環(huán)周期的細胞,具有較強的免疫抑制作用,這種抑制效應體現(xiàn)在減輕免疫器官重量、抑制巨噬細胞活性、抑制T細胞增殖及抗體分泌等各方面,故免疫學研究常以環(huán)磷酰胺作為細胞免疫、體液免疫中的免疫抑制模型的誘導藥物[12]。本研究采用經(jīng)典的環(huán)磷酰胺誘導免疫功能低下小鼠模型,考察車前草粗多糖對機體免疫力的調(diào)節(jié)作用,為車前草多糖的深入研究與新藥開發(fā)提供藥理學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

昆明種小鼠 SPF級,雌雄各半,體重18～22 g,許可證號:SCXK(遼)2015-0001,遼寧長生生物技術有限公司;車前草 大連市國藥大藥房,經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室王添敏副教授鑒定為正品;注射用環(huán)磷酰胺 江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司;鹽酸左旋咪唑片 山東仁和堂藥業(yè)有限公司;2,4-二硝基氟苯 成都艾科達化學試劑有限公司;丙酮國藥集團 化學試劑公司;碳酸鈉 北京化工廠;苯酚 天津市大茂化學試劑廠;葡萄糖標準品 壇墨質(zhì)檢-國家標準物質(zhì)中心;注射用印度墨汁 北京諾博萊德科技有限公司,臨用前以生理鹽水稀釋8倍;都氏試劑(Drabkin’s reagent) 使用時1μL都氏試劑以蒸餾水稀釋為1000 mL備用,Sigma公司;綿羊紅細胞(SRBC) 大連醫(yī)科大學實驗動物中心。

UV-5600型紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司;TG-16W型臺式離心機 長沙湘儀離心機有限公司;MA240D型電子分析天平 上海第二天平儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 車前草粗多糖的提取 參考文獻[13]方法。取干燥車前草粉碎,40目過篩,加入蒸餾水浸泡1 h,料液比1∶25 (g/mL),70 ℃恒溫水浴浸提1 h后,450 W微波處理4 min,冷卻至室溫,抽濾,棄去殘渣,收集濾液。濾液采用NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液調(diào)節(jié)pH至5.4～5.6,60 ℃水浴預熱(酶解溫度),加入車前草粉末質(zhì)量2%的木瓜蛋白酶,攪拌均勻,60 ℃下恒溫振蕩器振蕩(振蕩頻率95 Hz)2 h,脫去蛋白,然后置于沸水鍋中,沸水浴10 min滅活酶,冷卻至室溫。將提取液放置到離心管中,4000 r/min離心15 min,取上清液轉移到燒杯中,在燒杯中加入1%(m/v)的活性炭進行脫色處理,在恒溫振蕩器(60 ℃,95 Hz)上吸附40 min,吸附溫度調(diào)至60 ℃。吸附完成后將溶液轉入離心管中,4000 r/min離心15 min,取上清液,抽濾除去活性炭。濾液轉移到旋轉蒸發(fā)儀中,60 ℃濃縮至濾液體積的10%,按濃縮液與乙醇體積比1∶3加入無水乙醇沉淀多糖,攪拌均勻,4 ℃冰箱中靜置12 h過夜,抽濾,收集固體產(chǎn)物,真空冷凍干燥(-40 ℃),得到車前草粗多糖。按此方法提取4批,分別計算提取率。

提取率(%)=粗多糖質(zhì)量/干燥車前草質(zhì)量×100

1.2.2 車前草粗多糖含量測定 參考文獻[14]方法,采用硫酸-苯酚法測定所提取的車前草粗多糖中總糖含量。

標準曲線的繪制:稱取干燥至恒重的葡萄糖標準品，配制0.1 mg/mL的葡萄糖標準溶液。吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的0.1 mg/mL葡萄糖標準溶液于具塞試管中,加雙蒸水至1 mL,分別加入5%苯酚溶液1.0 mL,混勻,迅速加入濃硫酸5.0 mL,搖勻,靜置5 min,30 ℃水浴孵育20 min,靜置10 min;另取一試管,分別加入1.0 mL蒸餾水,1.0 mL苯酚與5.0 mL濃硫酸作為空白對照;490 nm波長處測吸光度(A值)。以葡萄糖濃度(mg/mL)為橫坐標,吸光度(A)為縱坐標繪制標準曲線。

總糖含量測定:稱取烘干的車前草粗多糖,配制為相應濃度,測定吸光度,根據(jù)標準曲線計算樣品中葡萄糖含量[15]。

車前草粗多糖中總糖含量(%)=(樣品溶液中葡萄糖質(zhì)量×樣品溶液的稀釋倍數(shù)/樣品質(zhì)量)×169

1.2.3 分組及給藥 小鼠在清潔級環(huán)境中飼養(yǎng),溫度(22±2) ℃,相對濕度40%～60%,控制照明時間為14 h，適應一周后開始實驗。各實驗均取60只小鼠,隨機分為6組,每組10只。分別為正常對照組,免疫低下模型組,車前草粗多糖高、中、低劑量組,左旋咪唑組(陽性對照)。車前草粗多糖高、中、低劑量組分別灌胃給予900、300、100 mg/kg的車前草粗多糖;左旋咪唑組灌胃給予25 mg/kg;正常對照組及模型組小鼠給予等體積蒸餾水。每天一次,連續(xù)21 d。

1.2.4 免疫低下模型的建造 在實驗結束前10 d(給藥第12 d),各組小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺注射液80 mg/kg,連續(xù)3 d,正常組小鼠腹腔注射等體積生理鹽水[16-17]。

1.2.5 車前草粗多糖對免疫低下小鼠炭粒廓清功能的影響 末次給藥后120 min,尾靜脈注射印度墨水0.1 mL/10 g,注射后選取不同時間(5、20 min),分別從眼眶靜脈叢取血25 μL溶于0.1% Na2CO32 mL溶液中,搖勻,在600 nm波長下比色,測定吸光度(A值),解剖小鼠,取肝、脾,稱重,計算廓清指數(shù)K值和校正廓清指數(shù)α值[18-19]。

廓清指數(shù)K=(lgA1-lgA2)/(t2-t1)

式中，A1、A2分別為5、20 min時的吸光度，t1、t2分別為5、20 min。

1.2.6 車前草粗多糖對免疫低下小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(delayed type hypersensitivity,DTH)的影響 首次給藥后第16 d，各組小鼠背部皮膚脫毛后，涂抹0.5%二硝基氟苯丙酮溶液50 μL致敏,第20 d測各組小鼠左后足足趾厚度,然后在測量部位皮下注射0.5%二硝基氟苯丙酮溶液10 μL激發(fā)反應,24 h后,用游標卡尺測量各組小鼠左后足趾厚度。每次測量均在同一部位連續(xù)測量3次,取平均值。以激發(fā)前后足趾厚度差表示DTH反應強度[20-21]。

1.2.7 車前草粗多糖對免疫低下小鼠體重的影響 整個實驗過程中每周測定體重2次,判斷車前草粗多糖對免疫低下小鼠體重的影響。

1.2.8 車前草粗多糖對免疫低下小鼠血清溶血素水平、胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)的影響 實驗中所用補體按下列方法制備:新鮮豚鼠3只混合血清,1 mL壓積SRBC加入到5 mL豚鼠血清中,于4 ℃吸收30 min,5 min輕輕振蕩1次,分裝,置-70 ℃以下備用,用時以生理鹽水液按1∶10稀釋,即配制為10%補體。

在首次給藥后第16 d,小鼠腹腔注射5% SRBC 0.2 mL/只,連續(xù)免疫3 d,免疫后5 d(即給藥后第21 d)眼眶后靜脈叢取血,分離血清,生理鹽水稀釋血清300倍;取1 mL稀釋后的血清依次加入反應管內(nèi),再加5% SRBC 0.5 mL、10%補體1 mL,置37 ℃水浴孵育30 min,移至冰浴終止反應;1500 r/min,4 ℃離心5 min,取上清液1 mL,加入3 mL都氏試劑,混勻,10 min后用分光光度計(540 nm)比色讀取OD值;取同實驗用的5% SRBC 0.25 mL,加入4 mL都氏試劑,10 min后在540 nm 處比色讀取A值,即為試驗中所用SRBC半數(shù)溶血時的A值[22]。

半數(shù)溶血值HC50=(樣品A值/SRBC半數(shù)溶血時的A值)×稀釋倍數(shù)

于末次實驗后，解部出胸腺及脾臟，分別稱量，計算各組小鼠胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結果與分析

2.1 車前草粗多糖提取率及總糖含量

通過不同濃度葡萄糖標準液的OD值,繪制標準曲線為Y=5.0343X+0.0013(R2=0.9999),然后計算得出4批次的車前草粗多糖的平均提取率為6.17%±0.63%。將其中提取率較高的3批車前草粗多糖均勻混合,測得總糖含量為(236.60±1.22) mg/g。

2.2 車前草粗多糖對免疫低下小鼠炭粒廓清功能的影響

機體免疫系統(tǒng)中,巨噬細胞是最先對抗原產(chǎn)生反應的免疫細胞之一,其吞噬功能反映機體的非特異性免疫功能[23]。而廓清指數(shù)K值和校正廓清指數(shù)α值可直觀反映巨噬細胞的吞噬功能。

由表1可知,與正常組比較,模型組小鼠的廓清指數(shù)K值和校正廓清指數(shù)α值極顯著降低(p<0.01),表明模型組小鼠的炭粒廓清功能極顯著下降(p<0.01),實驗建模成功;與模型組比較,車前草粗多糖高劑量組、左旋咪唑組小鼠的廓清指數(shù)K值和校正廓清指數(shù)α值極顯著升高(p<0.01),而車前草粗多糖的中、低劑量組對此兩指標無顯著性影響(p>0.05)。由此可知,適宜劑量的車前草粗多糖可明顯提高免疫低下小鼠的非特異性免疫功能。

表1 車前草粗多糖對免疫低下小鼠炭粒廓清反應的影響Table 1 Effects of crude polysaccharides from Plantago asiatica L. on the carbon clearance reaction in immunosuppressed mice

2.3 車前草粗多糖對免疫低下小鼠DTH反應的影響

DTH是檢測T細胞功能的體內(nèi)實驗方法之一,通過測定受試物對機體DTH反應的影響,可反應機體的T細胞功能或受試物的作用。由表2可得,與正常組相比,模型組小鼠的足趾厚度差極顯著減少(p<0.01),即DTH反應強度極顯著降低(p<0.01);與模型組相比,高、中劑量的車前草粗多糖以及左旋咪唑(25 mg/kg)會使免疫低下模型小鼠的足趾厚度差極顯著增加(p<0.01),而低劑量的車前草粗多糖雖對其也有增加作用,但并不顯著(p>0.05)。由此可知,適宜濃度的車前草粗多糖后可明顯增加免疫低下模型小鼠的足趾厚度差,即可增強模型小鼠DTH反應強度。

表2 車前草粗多糖對免疫低下小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應的影響Table 2 Effects of crude polysaccharides from Plantago asiatica L. on the DTH in immunosuppressed mice

2.4 車前草粗多糖對免疫低下小鼠體重的影響

給予環(huán)磷酰胺后,小鼠免疫功能受到抑制,同時伴有體重減輕[24]。表3結果顯示,注射環(huán)磷酰胺前(給藥第12 d),與正常組相比,各組小鼠體重均無顯著性差異(p>0.05),表明車前草粗多糖的3個劑量和左旋咪唑對小鼠體重無明顯影響;給藥第12 d注射環(huán)磷酰胺后,小鼠免疫功能開始受到抑制,給予環(huán)磷酰胺9 d后(給藥第21 d),與正常組相比,模型組小鼠體重極顯著下降(p<0.01),而灌胃車前草粗多糖(高、中、低)和左旋咪唑(25 mg/kg)后,小鼠體重下降受到抑制,與正常組無顯著性差異(p>0.05),表明車前草粗多糖對免疫低下小鼠體重的減輕具有一定程度的緩解作用。

表3 車前草粗多糖對免疫低下小鼠體重的影響Table 3 Effects of crude polysaccharides from Plantagoasiatica L. on the body weight in immunosuppressed mice

2.5 車前草粗多糖對免疫低下小鼠溶血素水平、胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)的影響

經(jīng)綿羊紅細胞(SRBC)免疫反應后,小鼠的淋巴細胞產(chǎn)生抗SRBC抗體(溶血素),可通過測定在體外溶血反應中釋放的血紅蛋白表示免疫小鼠血清中溶血素含量,反映機體特異性體液免疫功能。

表4結果顯示,與正常組小鼠比較,模型組小鼠溶血素水平極顯著下降(p<0.01);與模型組相比,高、中劑量的車前草粗多糖可極顯著提高免疫低下小鼠溶血素水平(p<0.01),且強于左旋咪唑(25 mg/kg)(與模型組相比,差異顯著(p<0.05)。由此可知,適量的車前草粗多糖對機體特異性體液免疫功能的恢復有明顯促進作用。

脾臟和胸腺都是人體重要的免疫器官,胸腺對維持細胞免疫和調(diào)節(jié)免疫反應起重要的作用[25]。免疫器官的重量是反映機體非特異性免疫功能的重要且直觀的指標，胸腺和脾臟指數(shù)能反映免疫器官的發(fā)育和免疫細胞的功能狀況,其數(shù)值高低客觀反映機體的非特異性免疫能力的大小。表4結果可見,與正常組相比，模型組小鼠注射環(huán)磷酰胺后,脾臟和胸腺發(fā)生萎縮,脾臟指數(shù)與胸腺指數(shù)極顯著降低(p<0.01);與模型組相比，灌胃高劑量車前草粗多糖和左旋咪唑均可極顯著升高免疫低下小鼠的脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)(p<0.01),中劑量車前草粗多糖可顯著升高免疫低下小鼠的脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)(p<0.05),而低劑量車前草粗多糖雖可升高免疫低下小鼠的脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù),但作用不顯著(p>0.05)。由此可知,適宜劑量的車前草多糖可對抗環(huán)磷酰胺引起的脾臟和胸腺的萎縮。

表4 車前草粗多糖對免疫低下小鼠溶血素水平、胸腺和脾臟指數(shù)的影響Table 4 Effects of crude polysaccharides from Plantago asiatica L. on hemolysin level,thymus and spleen index in immunosuppressed mice

3 結論

本研究考察車前草粗多糖對免疫抑制小鼠的免疫增強作用,研究發(fā)現(xiàn),適宜濃度的車前草粗多糖能明顯提高環(huán)磷酰胺所致免疫低下小鼠炭粒廓清能力(非特異性免疫指標),對免疫抑制小鼠的DTH反應(特異性免疫指標)具有一定刺激作用,可明顯提高免疫抑制小鼠的半數(shù)溶血值(特異性免疫指標),增加血清中抗體水平,對環(huán)磷酰胺引起的脾、胸腺萎縮具有抑制作用。綜上所述,車前草粗多糖對于環(huán)磷酰胺所致免疫抑制小鼠的非特異性、特異性體液免疫及特異性細胞免疫功能均具有增強作用,可能對于臨床免疫功能低下相關性疾病具有良好的治療效果,但對于其相關機制還需進行進一步的研究。