高效液相色譜分析真菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中的麥角硫因

許 晟,劉 琦,姜文俠,王 妍,周子振

(1.天津中科諾識生物科技有限公司,天津 300100;2.天津市工業(yè)生物系統(tǒng)與過程工程重點實驗室，中國科學院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308)

麥角硫因(ergothioneine,EGT),即巰基組氨酸三甲基內(nèi)鹽,是一種天然抗氧化劑[1],具有清除自由基[2]、解毒,維持DNA的生物合成、細胞的正常生長以及細胞免疫等多種生理功能[3-6]。

EGT的制備方法主要有化學合成法、天然生物提取法[7-9]及生物合成法。其中生物合成法[10-14],即利用真菌菌絲體深層發(fā)酵合成EGT,是合成EGT的發(fā)展方向。采用這種方式可以通過代謝調(diào)控提高產(chǎn)率,降低成本,并能夠保證產(chǎn)品的安全性,拓寬了EGT的應用空間。而建立EGT快速準確地檢測與分析方法,是發(fā)酵以及純化等后續(xù)工藝進行優(yōu)化的前提,對于研究和生產(chǎn)都至關(guān)重要。國內(nèi)外有學者采用C18色譜柱[15-18]、HILIC色譜柱[19]和氨基色譜柱[20]檢測EGT。其中C18色譜柱法對色譜柱損耗較大,檢測成本高,HILIC色譜柱法檢測時間較長,而氨基酸色譜柱法所用流動相中有機溶劑含量較大,檢測廢液對環(huán)境污染較嚴重。

本文利用反相耐水色譜柱Zorbax-SB-Aq建立了EGT的定量檢測方法,相較于以上方法,具有檢測時間短,流動相中有機溶劑含量低、污染小等優(yōu)點,同時在菌絲體和發(fā)酵液等成分復雜樣品的檢測過程中,保持了良好的分離度和穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

糙皮側(cè)耳(Pleurotusostreatus,CGMCC No. 6232) 保存于中國科學院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所——姜文俠課題組;麥角硫因?qū)φ掌?純度≥98%) Enzo Life Sciences公司;甲醇、乙酸(色譜級) 德國默克生物科技有限公司;玉米粉 梅河口市興達米業(yè)有限責任公司;豆粕粉 北京中棉紫光生物科技有限公司;磷酸二氫鉀、硫酸鎂 分析純，天津市北方天醫(yī)化學試劑廠;α-淀粉酶 美國Solarbio科技有限公司;甘油(分析純) 天津市風船化學試劑科技有限公司;胰酪胨 北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；PDA培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

ZORBAX SB-Aq(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱 美國Agilent公司;ZORBAX Eclipse XDB-C18(5 μm,250 mm×4.6 mm)色譜柱 美國Agilent公司;1260 Infinity高效液相色譜儀 美國Agilent公司;Agilent 1200-Sprak Prospekt2-Bruker AVANCE III 600 MHz/Bruker microOTOF-QII 液相質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司、德國Bruker公司;AX205DR電子天平 瑞士METTLER TOLEDO公司;TGL-16M離心機 湖南湘儀有限公司;MS 3 digital漩渦振蕩器 德國IkA公司;超濾離心管(3 kDa,1.5 mL) 美國MiliPORE公司;Milli-Q Reference超純水機 美國MiliPORE公司;SCIENZE SB-5200D超聲清洗機 寧波新芝生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 種子培養(yǎng)基：玉米粉30.0 g/L,豆粕粉15.0 g/L,磷酸二氫鉀3.0 g/L,硫酸鎂1.5 g/L,α-淀粉酶80 U/L,自然pH,500 mL三角瓶裝液量為150 mL,121 ℃滅菌20 min;

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：甘油50.0 g/L,胰酪胨35.0 g/L,KH2PO43.0 g/L,MgSO4·7H2O 1.5 g/L,自然pH,500 mL三角瓶裝液量為150 mL,121 ℃滅菌20 min。

1.2.2 發(fā)酵液的制備 發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)方法:挑取CGMCC 6232斜面菌種約1 cm2,接種至種子培養(yǎng)基,25 ℃搖床150 r/min培養(yǎng)96 h,制備種子液。將種子液按體積比5%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基,25 ℃搖床150 r/min培養(yǎng)15 d,制備菌絲體發(fā)酵液。當培養(yǎng)基中甘油和胰酪胨的添加比例為5∶4和5∶3，其他培養(yǎng)條件同上時，得到兩個樣品分別為3-14d-1和3-14d-2；當在25 ℃搖床150 r/min下培養(yǎng)時間為254 h和304 h，其他培養(yǎng)條件同上時，得到兩個樣品分別為FJ-009-254h和FJ-009-304h。

1.2.3 樣品的前處理 取適量的菌絲體發(fā)酵液,置于90 ℃,300 r/min的磁力攪拌器上浸提30 min,取上清液經(jīng)膜孔徑3 kDa的超濾管在12840×g的條件下離心10 min,透過液即為EGT待測樣品。

1.2.4 HPLC-MS檢測條件 離子源ESI,離子阱檢測器;檢測模式:正離子檢測;噴霧電壓:4.5 KV;氮氣流速:3 L/min;毛細管溫度:220 ℃;毛細管電壓:10 V;采用全離子掃描方式,掃描范圍:50～450 m/z。

1.2.5 HPLC檢測條件 色譜柱:兩根ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)串聯(lián);流動相為A(純水:甲醇=95:5/V:V,使用硼酸和氨水調(diào)節(jié)流動相的pH至5.0);流速0.7 mL/min;檢測波長:257 nm;柱溫:25 ℃;進樣量:5 μL。

1.2.6 色譜條件的優(yōu)化 分別對檢測波長、流動相組成與比例、流動相pH、流速和柱溫以及梯度條件進行了優(yōu)化。

1.2.7 方法學驗證 對建立的檢測方法進行了專屬性考察、檢出限和定量限、精密性、線性范圍、穩(wěn)定性考察(日內(nèi)、日間穩(wěn)定性)和加標回收率考察。

1.2.8 對照品溶液的配制及標準曲線的繪制 精密稱量10 mg的麥角硫因?qū)φ掌?溶解于5 mL的超純水中,轉(zhuǎn)移至10 mL的容量瓶,使用超純水定容、混勻,配制成濃度為1000 mg/L的對照品儲備液,于-20 ℃冷凍保存。使用前,置于10 ℃水中自然融化,隨后分別取上述儲備液0.25、0.5、1、2、4 mL,稀釋至10 mL,配制成濃度為25、50、100、200和400 mg/L的對照品溶液,也可根據(jù)需要可按照比例配制其它濃度的對照品溶液,隨后進行HPLC測定,進樣量為5 μL,根據(jù)積分所得的峰面積與濃度繪制標準曲線。

1.2.9 雙C18色譜柱串聯(lián)檢測與SB-aq色譜柱檢測方法的對比實驗 分別進行對照品檢測對比實驗、相同樣品的檢測結(jié)果比較、以及利用液相-質(zhì)譜聯(lián)用對兩種檢測方法進行驗證。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本文數(shù)據(jù)處理軟件包括:Agilent液相色譜儀工作站 Chemstation Edition(版本C.01.07.SR3),Microsoft Office Excel 2007。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化

2.1.1 檢測波長的確定 取適量EGT對照品溶液,先后在190～400 nm和250～270 nm范圍內(nèi)進行紫外全波長掃描,確定EGT在257 nm處有最大吸收,故選擇257 nm作為檢測波長。掃描光譜圖見圖1a、圖1b。

圖1 EGT對照品的掃描光譜圖Fig.1 Scanning spectrum of EGT standard

2.1.2 流動相組成與比例的選擇和優(yōu)化 選擇甲醇-水和乙腈-水作為流動相進行優(yōu)化,兩種流動相對EGT的分離效果無明顯差別。如圖2～圖4所示,當流動相為甲醇∶水=10∶90和乙腈∶水=10∶90時,EGT與雜質(zhì)峰的分離度分別為0.91和0.85,流動相為甲醇∶水=1∶99時,EGT與雜質(zhì)峰的分離度為1.78?？紤]到乙腈的毒性較大和價格較高,故采用甲醇-水作為流動相。實驗發(fā)現(xiàn),甲醇與水的比例越小,EGT與雜質(zhì)的分離效果越好。同時考慮到色譜柱保護的需要,將甲醇與純水的比例確定為1∶99。

圖2 甲醇∶水=10∶90的HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatogram of 10% methanol concentration

圖3 乙腈∶水=10∶90的HPLC圖譜Fig.3 HPLC chromatogram of 10% acetonitrile concentration

圖4 甲醇∶水=1∶99的HPLC圖譜Fig.4 HPLC chromatogram of 1% methanol concentration

2.1.3 流動相pH的優(yōu)化 分別利用乙酸、甲酸、氨水、三乙胺等試劑調(diào)節(jié)流動相的pH至4.0～6.0,發(fā)現(xiàn)使用20%的乙酸和50%的氨水調(diào)節(jié)流動相的pH為5.0,EGT的峰形及與雜質(zhì)的分離度最好。

2.1.4 流速和柱溫的優(yōu)化 當流速從0.5 mL/min變化到1.5 mL/min時,EGT的峰形變窄,保留時間逐漸提前,由8 min左右變化至5 min左右,節(jié)省了檢測時間,但降低了與雜質(zhì)的分離度。柱溫在20～35 ℃時,隨著溫度升高,EGT的保留時間提前,峰形變窄,但與雜質(zhì)的分離度也降低。綜合考慮檢測時間、分離度和峰形,選擇流動相的流速為0.7 mL/min,柱溫為30 ℃。

2.1.5 梯度條件的選擇 由于發(fā)酵樣品雜質(zhì)較多,若保持等度洗脫,隨著雜質(zhì)的積累,會導致柱壓升高,影響檢測的穩(wěn)定性,同時也會縮短色譜柱的使用壽命,增加檢測成本。因此建立了梯度洗脫建立程序:首先在50 min內(nèi)完成B相0%～100%的變化,根據(jù)色譜圖,調(diào)整Δ%B和相應的時間,保持梯度陡度不變,減少色譜圖中的空白部分。將梯度時間再縮短1/3,觀察目標峰與雜質(zhì)峰的分離效果(RS>1.5),在此前提下,進一步增大陡度以減少洗脫時間。最終建立的梯度洗脫程序如表1所示,在滿足了EGT與雜質(zhì)良好分離的前提下,檢測時間達到最短。

表1 流動相的梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

2.2 方法學驗證

2.2.1 專屬性考察 取EGT對照品和搖瓶發(fā)酵樣品按照方法1.2.1和1.2.3進行處理,根據(jù)2.1優(yōu)化的檢測條件進行檢測,檢測圖譜如圖5和圖6。由圖6可知,EGT的保留時間為5.863 min,與雜質(zhì)峰的分離度為2.24,滿足中國藥典對于分離度的要求達到1.5以上。

圖5 EGT對照品的HPLC圖譜Fig.5 HPLC chromatograms of EGT standeard solution

圖6 EGT發(fā)酵樣品的HPLC圖譜Fig.6 HPLC chromatograms of EGT fermentation sample

利用液相質(zhì)譜聯(lián)用儀對該方法進行專屬性驗證,結(jié)果如圖7。EGT的色譜峰與質(zhì)荷比為230.096的EGT質(zhì)譜信號基本重合,且該色譜峰內(nèi)無其他質(zhì)譜信號?？紤]到質(zhì)譜的死體積大于液相色譜,質(zhì)譜峰的保留時間會略長于色譜峰,故未能完全重合。上述證明了液相色譜圖中所確定的色譜峰為EGT峰,且與雜質(zhì)實現(xiàn)了良好的分離,專屬性符合檢測要求。

圖7 搖瓶發(fā)酵樣品的HPLC-MS圖譜Fig.7 HPLC-MS chromatograms of fermentation sample

2.2.2 檢出限和定量限 分別配制濃度范圍為0.01～1 μg/L的EGT對照品溶液,按照濃度由低到高的順序進行檢測,根據(jù)信噪比為3和10,確定EGT的檢出限和定量限分別是0.045和0.900 μg/L。

2.2.3 標準曲線的繪制 按照1.2.1所述方法精密配制濃度范圍為1～1000 mg/L的EGT對照品溶液,按2.1優(yōu)化的檢測條件進行檢測,根據(jù)EGT的濃度與峰面積繪制標準曲線。如圖8,EGT在2.5～1000 mg/L的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,線性回歸方程為y=31.06x+273.31,R2為0.9991。

圖8 EGT對照品的標準曲線Fig.8 Standard curve of ergothioneine standeard solution

2.2.4 精密性試驗 取搖瓶發(fā)酵搖瓶樣品,按照1.2.3所述方法進行處理后,得到待測樣,連續(xù)進樣6次,檢測結(jié)果的相對偏差RSD為0.33%,說明該檢測方法的精密度良好。

2.2.5 穩(wěn)定性考察

2.2.5.1 日內(nèi)穩(wěn)定性考察 取1份搖瓶發(fā)酵樣品于室溫下分別放置0、2、4、6、8、10、12 h,按照方法1.2.3處理后進行檢測,每個時間點的樣品平行測定3次,計算檢測結(jié)果的相對標準偏差RSD為1.89%,說明待測樣品中的EGT含量在12 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.2.5.2 日間穩(wěn)定性考察 另取1份搖瓶發(fā)酵樣品儲存在-20 ℃的冰箱中,于第1、7、11、14 d其進行檢測,四次檢測結(jié)果的RSD為0.026%,說明在14 d內(nèi),樣品中的EGT濃度保持穩(wěn)定,日間穩(wěn)定性良好。

2.2.6 加標回收率考察 取一份已知EGT含量的搖瓶發(fā)酵樣品,分別加入相當于樣品中EGT含量為75%、100%和125%的對照品溶液,根據(jù)檢測結(jié)果計算EGT的回收率,見表2。

表2 EGT加樣回收率的測定結(jié)果Table 2 The addition recovery of EGT

由表2得知,樣品的加標回收率都在90%～110%之間,符合定量檢測的要求[21]。

2.3 與雙C18色譜柱串聯(lián)檢測方法的比較

2.3.1 對照品檢測對比試驗 按照1.2.6進行試驗,結(jié)果見表3和表4,明顯可見,利用SB-aq色譜柱檢測時，相同濃度的麥角硫因?qū)φ掌啡芤悍迕娣e一直穩(wěn)定,而利用雙C18色譜柱檢測時，相同濃度的麥角硫因?qū)φ掌啡芤悍迕娣e一直在變小,偏差較大。出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因,可能與兩種色譜柱的調(diào)料不同有關(guān)。普通C18色譜柱的固定相疏水性較強,在高比例水相條件下,易引起固定相疏水塌陷,導致柱效迅速下降,影響響應強度,進而導致隨著使用時間變長,對照品峰面積逐漸變小,而SB-aq色譜柱的固定相具有較大的二異丙基側(cè)鏈基團,避免了色譜柱在低pH、高比例水相條件下被水解破壞,進而保證相同濃度對照品的峰面積能夠一直保持比較穩(wěn)定的水平。

表3 利用SB-aq色譜柱對EGT對照品進行檢測結(jié)果Table 3 The result of ergothioneine standeard solution test in 4 weeks by SB-aq column

表4 利用雙C18色譜柱串聯(lián)對EGT對照品進行檢測結(jié)果Table 4 The result of ergothioneine standeard solution test in 4 weeks by C18 column

2.3.2 相同樣品的檢測結(jié)果比較 另取4個搖瓶發(fā)酵樣品,按1.2.3進行樣品制備,隨后利用兩種檢測方法進行檢測,結(jié)果如表5所示:對于4個不同樣品,兩種檢測方法的檢測結(jié)果均相差較大,采用SB-Aq色譜柱檢測樣品中的EGT含量低于C18柱檢測的同一樣品中的EGT含量。后續(xù)利用HPLC-MS對兩種方法進行驗證。

表5 同一樣品的兩種檢測方法檢測結(jié)果比較Table 5 Test results of same sample by two differert test methods

2.3.3 利用HPLC-MS驗證兩種檢測方法

2.3.3.1 對C18色譜檢測方法的質(zhì)譜驗證 利用液相質(zhì)譜聯(lián)用儀對C18柱分離的搖瓶發(fā)酵樣品3-14D-1和FJ-009-254 h進行色譜峰純度檢測,結(jié)果如圖9、圖10。由圖中可以看出,采用C18色譜柱對成分較為復雜的樣品的分離效果較差。前者在EGT色譜峰的對應位置還包含質(zhì)荷比約為118.077、140.068、522.202、527.157和622.253的五個質(zhì)譜雜質(zhì)信號,后者在EGT色譜峰的對應位置還包含質(zhì)荷比約為118.084和277.089的兩個質(zhì)譜雜質(zhì)信號。

圖9 C18柱檢測樣品3-14D-1的HPLC-MS譜圖Fig.9 HPLC-MS chromatograms of sample 3-14D-1 by C18 chromatographic column

圖10 C18柱檢測樣品FJ-009-254h的HPLC-MS譜圖Fig.10 HPLC-MS chromatograms of sample FJ-009-254h by C18 chromatographic column

2.3.3.2 對SB-Aq檢測方法的質(zhì)譜驗證 由圖11、圖12可看出,與C18柱的檢測結(jié)果相比,SB-Aq柱對搖瓶發(fā)酵樣品的分離效果更佳,在257 nm下,EGT色譜峰與EGT質(zhì)譜峰的保留時間基本一致,同時色譜峰的對應位置不包含其它雜質(zhì)的質(zhì)譜峰,說明了利用SB-Aq色譜柱分離得到的EGT色譜峰純度更高,對于發(fā)酵樣品中EGT的含量測定結(jié)果更準確。

圖11 SB-Aq色譜柱檢測樣品3-14D-1的HPLC-MS譜圖Fig.11 HPLC-MS chromatograms of sample 3-14D-1 by ZORBAX SB-Aq chromatographic column

圖12 SB-Aq色譜柱檢測樣品FJ-009-254h的得HPLC-MS譜圖Fig.12 HPLC-MS chromatograms of sample FJ-009-254h by SB-Aq chromatographic column

3 結(jié)論

本文建立的HPLC檢測方法能夠快速、簡便地檢測樣品中的EGT含量。所用流動相中只含體積比為1%的甲醇,對環(huán)境污染很小,EGT保留時間為6 min,對于雜質(zhì)較多的發(fā)酵樣品,進行梯度洗脫程序的檢測時間也僅為38 min,建立的梯度洗脫程序可以清除雜質(zhì)的積累,增強了方法的穩(wěn)定性,延長了色譜柱的使用時間。經(jīng)統(tǒng)計,檢測200個樣品之后,柱壓依然保持在初始狀態(tài),且峰形、分離度均保持穩(wěn)定良好水平。利用液質(zhì)聯(lián)用證明了本方法適合于檢測成分較為復雜的發(fā)酵樣品中的EGT含量。該方法的線性、精密度、穩(wěn)定性及加標回收率均滿足定量檢測的要求,可廣泛應用于各種EGT樣品的定量檢測。