南極磷蝦粉脫脂前后胰蛋白酶降解產(chǎn)物的變化

姜曉明,胡玲萍,張曉梅,張鴻偉,徐蓓蓓,趙 雪,薛長湖,*

(1.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266003;2.山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心,山東青島 266002)

南極磷蝦作為地球上生物蘊藏量最大的物種[1],其資源的開發(fā)引起全世界越來越多的關(guān)注。南極磷蝦的蛋白含量為11.9%～15.4%[2],蛋白的營養(yǎng)高于一般畜禽肉蛋白和牛乳蛋白,含有全部的人體必需氨基酸,必需氨基酸的總量達到212.1 mg/g蛋白質(zhì)[3]。目前,南極磷蝦的主要產(chǎn)品形式有南極磷蝦粉和南極磷蝦油[4]。脫脂南極磷蝦粉為南極磷蝦提取蝦油后的產(chǎn)物,對其進行酶解可以得到活性多肽。

目前對南極磷蝦多肽的研究主要集中在制備工藝優(yōu)化及活性研究。倪玲等[5]使用胰蛋白酶聯(lián)合自溶對南極磷蝦酶解液多肽的含量、分子量進行分析。李明杰等[6]優(yōu)化了利用木瓜蛋白酶制備南極磷蝦多肽的工藝,并進行了抗氧化活性測定。此外,研究者還對南極磷蝦多肽的抑菌活性[7]、ACE抑制活性[8]、抗骨質(zhì)疏松活性[9]等進行了研究。

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、環(huán)境和食品等領(lǐng)域[10],特別是食品領(lǐng)域,諸如過敏原檢測[11]、食品鑒定[12]、農(nóng)獸藥殘留等[13]。近年來,隨著基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)及生物信息學(xué)的發(fā)展,將蛋白與多肽的研究與生物體的基因、轉(zhuǎn)錄和代謝相關(guān)聯(lián),LC-MS技術(shù)也成為蛋白與多肽研究的重要手段[10],因此利用LC-MS 對南極磷蝦蛋白和多肽的鑒定、定性定量分析及在組學(xué)中的更深入研究具有重要意義。本研究以南極磷蝦凍蝦和脫脂南極磷蝦粉為原料,利用質(zhì)譜技術(shù)研究南極磷蝦在加工成蝦粉前后的胰蛋白酶降解產(chǎn)物的變化,以期探討脫脂加工對南極磷蝦蛋白及其酶解產(chǎn)物的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南極磷蝦 遼寧省大連海洋漁業(yè)集團公司;測序級胰蛋白酶(比活18523 U/mg) 美國Promega公司;質(zhì)譜級甲酸 美國Sigma公司;乙腈 美國Fisher公司;碘代乙酰胺 美國Sigma公司;二硫蘇糖醇、尿素、碳酸氫銨 國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1260高效液相色譜儀 美國Agilent公司;AB SCIEX Triple TOFTM5600質(zhì)譜儀 美國AB SCIEX公司;Triple QuadTM5500三重四級桿質(zhì)譜儀 美國AB SCIEX公司;MQS50001型超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司;AB135-S型精密電子分析天平 瑞士Mettler-Toledo公司;A11 基本型分析研磨機 德國IKA公司;CR21G II高速冷凍離心機 日本CHTACHI公司;DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司;HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司;UFC501008超濾管 美國Millipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 上樣前預(yù)處理

1.2.1.1 脫脂南極磷蝦粉制備 冷凍南極磷蝦塊在微波源頻率915 MHz條件下，微波快速解凍5 min至個體間離散,100 ℃蒸汽處理20 min,瀝干水分并在60 ℃下充分干燥,粉碎成粉末[14],加入10倍體積的95%乙醇溶液，在室溫下浸泡磷蝦粉4 h,期間磁力攪拌并更換一次95%的乙醇,4500 r/min離心15 min。沉淀在室溫下?lián)]干乙醇,于60 ℃充分烘干,制得脫脂南極磷蝦粉。

1.2.1.2 南極磷蝦蛋白提取液的制備 取南極磷蝦凍蝦蝦肉,液氮研磨成粉末狀,取1 g凍蝦粉于50 mL EP管中,加入10 mL蛋白提取液(8 mol/L尿素,50 mmol/L NH4HCO3),振蕩提取蛋白30 min,高速低溫離心15 min(4 ℃,10000 r/min),即為南極磷蝦蛋白提取液。脫脂南極磷蝦粉取1 g,處理方法同上。

1.2.1.3 南極磷蝦蛋白酶解 取上述蛋白提取液上清液100 μL到1 mL EP管中,加2 μL 1 mol/L二硫基蘇糖醇，于37 ℃反應(yīng)1 h。取10 μL 1 mol/L現(xiàn)配的碘代乙酰胺,加入到已經(jīng)冷卻至室溫的上述反應(yīng)液中,室溫避光反應(yīng)1 h。采用10 kDa濾膜8000×g離心超濾30 min后,每次用200 μL碳酸氫銨溶液(50 mmol/L NH4HCO3)洗滌膜上層蛋白質(zhì),共洗滌三次。按酶底比1∶50將胰蛋白酶溶液分別加入到上述蛋白溶液中，37 ℃酶解16 h,使酶解徹底[15]。采用10K濾膜10000×g離心超濾30 min,收集下層的肽段濾液,定容至200 μL左右,待上機檢測。

1.2.2 液相色譜和質(zhì)譜條件 色譜柱:C18(4.6 mm×150 mm,5 μm);柱溫:40 ℃。流動相A:0.1%甲酸-乙腈,流動相B:0.1%甲酸-水;流速:0.25 mL/min;進樣量:30 μL;進樣時間:46 min;流動相梯度:0～2 min(95% B),2～17 min(95%～80% B),27～37 min(85～65%B),37～39 min(65%～20%B),39～42 min(20%～95% B),42～46 min(95% B)。

質(zhì)譜掃描范圍:350～1500 Da,正離子反應(yīng)模式,霧化氣GS1:35 psi,輔助加熱器GS2:45 psi,氣簾氣壓35 psi,噴霧電壓5500 eV,離子源溫度:500 ℃,解簇電壓:100 V,碰撞能量:10 eV,信號強度閾值:2e4。

1.2.3 冷凍南極磷蝦和南極磷蝦粉蛋白水解物的主成分分析 使用SMICA軟件建立PCA模型,進行主成分分析，以可視化樣品的總體情況,選擇單位方差標(biāo)度(Unit variance scaling)。

1.2.4 冷凍南極磷蝦和南極磷蝦粉蛋白水解物的正交偏最小二乘法判別分析 使用SMICA軟件建立OPLS-DA模型,進行正交偏最小二乘法判別分析,來篩選兩個樣品的差異肽段,選擇變量除以變量的方差的平方根標(biāo)度(Pareto scaling)。

1.2.5 南極磷蝦凍蝦和脫脂南極磷蝦粉的差異性肽段分析 對初篩得到差異性肽段在Peak View軟件進行色譜峰提取,進一步確認是否為差異性肽段。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用MarkerViewTMSoftware和ProteinPilotTMSoftware軟件進行數(shù)據(jù)的處理和分析,選用NCBI的南極磷蝦數(shù)據(jù)庫(NCBI-Euphausua superba.fasta)進行數(shù)據(jù)的檢索。

MarkerView軟件設(shè)置如下:最小保留時間2 min,最大保留時間40 min;設(shè)置數(shù)據(jù)的組的分類標(biāo)志。

ProteinPilot軟件參數(shù)設(shè)置如下:搜庫方法:Paragon method;消化:Trypsin;儀器:TripleTOF 5600;物種:None;ID Focus:Amino acid Subtitutions,Biological modifications;Search Effort:Thorough ID;檢測蛋白質(zhì)閾值(Unused Protscore(conf)):>0.05%(10.0%);提交錯誤發(fā)現(xiàn)率(False Discovery rate analysis,FDR)分析報告。

2 結(jié)果與分析

2.1 南極磷蝦和南美白對蝦的蛋白水解物的LC-MS/MS分析

冷凍南極磷蝦和脫脂南極磷蝦粉的胰蛋白酶水解產(chǎn)物通過LC-MS/MS檢測分析,觀察得到的譜圖,數(shù)據(jù)采集情況良好,譜圖重現(xiàn)性好。圖1為冷凍南極磷蝦和脫脂南極磷蝦粉蛋白水解產(chǎn)物得到的有代表性的的總離子流色譜圖和二級質(zhì)譜圖。結(jié)果表明,兩種磷蝦蛋白的總離子流色譜圖和二級質(zhì)譜圖整體具有一定相似性,但局部具有明顯差異,并且譜峰比較尖銳,峰形較為對稱,這為后續(xù)分析打下了良好的基礎(chǔ)。

圖1 南極磷蝦凍蝦和脫脂南極磷蝦粉的代表性總離子流色譜圖和二級質(zhì)譜圖Fig.1 Representative total ion current and stage-two mass spectrum of hydrolysate from two kinds of materials注:A、B分別為南極磷蝦凍蝦的總離子流色譜圖和二級質(zhì)譜圖;C、D分別為脫脂南極磷蝦粉的總離子流色譜圖和二級質(zhì)譜圖。

2.2 南極磷蝦凍蝦和脫脂南極磷蝦粉降解產(chǎn)物多肽的鑒定及對應(yīng)的蛋白信息

南極磷蝦凍蝦和脫脂南極磷蝦粉胰蛋白酶降解產(chǎn)物經(jīng)高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜檢測的數(shù)據(jù)在Protein Pilot軟件中用NCBI中南極磷蝦庫進行搜庫。在95%的置信度下,南極磷蝦凍蝦酶解產(chǎn)物中共鑒定到222條多肽,對應(yīng)的蛋白種類為28種,脫脂南極磷蝦粉酶解產(chǎn)物中共鑒定到215條多肽,對應(yīng)的蛋白種類為27種,同一序列不同修飾視為同一多肽,序列相同但來自不同蛋白的視為不同多肽。南極磷蝦凍蝦和脫脂南極磷蝦粉的分子量分布如圖2所示,鑒定得到的多肽和蛋白信息如表1所示。

表1 南極磷蝦凍蝦和脫脂南極磷蝦粉中被鑒定的多肽及蛋白信息Table 1 Common protein and peptide information of frozen Antarctic krill and Antarctic krill powder

圖2 南極磷蝦凍蝦和脫脂南極磷蝦蝦粉肽段的分子量分布圖Fig.2 Molecular weight distribution of frozen Antarctic krill and Antarctic krill powder peptides

2.3 冷凍南極磷蝦和南極磷蝦粉蛋白水解物的主成分分析(PCA)

本實驗采用SIMCA軟件對冷凍南極磷蝦和脫脂南極磷蝦粉蛋白的水解產(chǎn)物的歸一化數(shù)據(jù)進行主成分分析,得到PCA模型的得分圖和載荷圖如圖3所示。得分圖可以顯示組別,對樣品進行歸類[16],能夠直觀的顯示數(shù)據(jù)組之間有無差異,載荷圖能反映因子對主成分的貢獻大小,在某一具體主成分方向上距離原點越遠的因子對此主成分產(chǎn)生的貢獻越大[17]。

圖3 冷凍南極磷蝦和脫脂南極磷蝦粉的PCA模型Fig.3 PCA model of hydrolysates of frozen Antarctic krill and Antarctic krill powder注:A為冷凍南極磷蝦和脫脂南極磷蝦粉的PCA圖,B為PCA模型的載荷圖。

分析得到的得分圖中南極磷蝦凍蝦和脫脂南極磷蝦粉的樣品點集中,A圖中左邊方形點代表脫脂南極磷蝦粉,右邊圓形的點代表南極磷蝦凍蝦,兩組樣品分別聚集在各自的組中并位于兩個不同的區(qū)域,說明兩個樣品可以很好的被區(qū)分。載荷圖顯示,大多數(shù)的數(shù)據(jù)點聚集在一起,而離群的差異數(shù)據(jù)點,正是導(dǎo)致南極磷蝦凍蝦和脫脂南極磷蝦粉具有顯著差異的原因,可以初步找出差異的肽段。從PCA模型可以看出本實驗建立的模型較好,可以進行進一步分析。

2.4 冷凍南極磷蝦和南極磷蝦粉蛋白水解物的OPLS-DA分析

圖4為南極磷蝦凍蝦和脫脂南極磷蝦粉OPLS-DA及S-plot圖。OPLS-DA模型可提供數(shù)量更大、更準(zhǔn)確的信息。采用所建立的S-plot圖篩選導(dǎo)致南極磷蝦凍蝦和脫脂南極磷蝦粉差異的特征肽段。對兩組樣本分類貢獻較大的肽段通常位于S-plot圖中遠離中心原點的位置,即離中心的距離越遠,對分類的影響越大[17]。

2.5 南極磷蝦凍蝦和脫脂南極磷蝦粉的差異性肽段分析

篩選S型兩端的肽段,共得到40條區(qū)分南極磷蝦凍蝦和脫脂南極磷蝦粉的差異性肽段,如表2所示。

表2 南極磷蝦凍蝦和脫脂南極磷蝦的差異性多肽信息Table 2 Different peptide information of frozen Antarctic krill and Antarctic krill powder

對篩選出的40條差異性肽段進行AB5500三重四級桿的MRM驗證,最終得出四條南極磷蝦凍蝦中的特征肽段,他們分別為ASVHVDLPGWAK、EDMELQK、LQNAEGEVAALNR和DQVSEALLK,它們肽段斷裂圖如圖4所示,前兩條肽段來源于南極磷蝦的精氨酸激酶,后兩條肽段來源于南極磷蝦的原肌球蛋白,具體信息如下:

圖4 冷凍南極磷蝦和南極磷蝦粉蛋白水解物的OPLS-DA及S-plot圖Fig.4 OPLS-DA and S-plot of hydrolysate of frozen Antarctic krill and Antarctic krill powder

SEQ ID NO.1:ASVHVDLPGWAK,來自于蛋白arginine kinase[Euphausia superba],其在NCBI上的Accesion number是gi|588481755,分析發(fā)現(xiàn)未發(fā)現(xiàn)修飾。其母離子m/z為676.35,子離子m/z分別為:1094.56、844.42、729.39、616.31、547.79,其肽段斷裂圖如圖5A所示。

SEQ ID NO.2:EDMELQK,來自于蛋白arginine kinase[Euphausia superba],其在NCBI上的Accesion number是gi|588481755,分析發(fā)現(xiàn)cleaved A-E@N-term。其母離子m/z為446.71,子離子m/z分別為:648.34、517.30、388.26、275.17、147.11,其肽段斷裂圖如圖5B所示。

SEQ ID NO.3:LQNAEGEVAALNR,來自于蛋白tropomyosin[Euphausia superba],其在NCBI上的Accesion number是gi|162286973,分析發(fā)現(xiàn)其cleaved A-L@N-term。其母離子m/z為692.86,子離子m/z分別為:1143.58、1029.53、958.50、829.45、456.72,其肽段斷裂圖如圖5C所示。

SEQ ID NO.4:DQVSEALLK,來自于蛋白tropomyosin[Euphausia superba],其在NCBI上的Accesion number是gi|162286973,分析發(fā)現(xiàn)其cleaved L-D@N-term。其母離子m/z為501.78,子離子m/z分別為:759.46、660.39、444.32、260.20、244.09,其肽段斷裂圖如圖5D所示。

圖5 差異性多肽肽段在AB5500上的肽段斷裂圖Fig.5 Characteristic peptides fracture information on AB5500注:A. ASVHVDLPGWAK;B. EDMELQK;C. LQNAEGEVAALNR;D. DQVSEALLK。

Arginine kinase SEQ ID:

Tropomyosin SEQ ID:

分析導(dǎo)致差異的原因,原肌球蛋白和精氨酸激酶為甲殼類過敏原,加熱食物到一定程度可以去除或降低過敏性,原因是蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象及三維結(jié)構(gòu)在加熱條件下會發(fā)生變化,破壞蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)[18],南極磷蝦在加工成脫脂蝦粉過程中采用了蒸煮,熱處理會使原肌球蛋白和精氨酸激酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,這可能是導(dǎo)致南極磷蝦凍蝦加工成脫脂蝦粉后胰蛋白酶降解產(chǎn)物發(fā)生變化的原因。此外,在加工過程中還進行了微波解凍,有研究表明微波能使過敏蛋白的空間構(gòu)型發(fā)生改變,使分子間的連接方式發(fā)生改變,導(dǎo)致鍵的破壞和重組[19],這也可能是導(dǎo)致南極磷蝦在脫脂加工前后胰蛋白酶降解產(chǎn)物變化的原因。

3 結(jié)論

本實驗基于飛行時間質(zhì)譜以及三重四級桿所提供的高質(zhì)量質(zhì)譜數(shù)據(jù),采用Markerview軟件對數(shù)據(jù)進行篩選,并用SMICA軟件數(shù)據(jù)進行多元統(tǒng)計分析,結(jié)果表明所建立的PCA模型和OPLS-DA模型均能夠很好地區(qū)分兩組樣品,初篩出的40條差異性肽段通過AB5500的MRM驗證，最終篩選出4條南極磷蝦凍蝦中特有而在加工成脫脂蝦粉過程中丟失的特征肽段,它們分別是ASVHVDLPGWAK、EDMELQK、LQNAEGEVAALNR和DQVSEALLK。本實驗為南極磷蝦加工前后的成分鑒定提供了一種高效、準(zhǔn)確的分析方法,可以為多肽組學(xué)的研究提供一定的參考。