微囊化Penicillium purpurogenum Li-3細(xì)胞的制備及其催化性能研究

黃曉林,曹 紅,歐陽巧鳳,沈瑞麟,李 春,吳廷華,*

(1.浙江師范大學(xué)物理化學(xué)研究所,浙江金華 321004;2.嘉興學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院,浙江嘉興 314001;3.石河子大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,新疆石河子 832003;4.北京理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京 100081)

甘草酸(Glycyrrhizic acid,GL)具有抗炎癥、抗病毒、抗腫瘤、抗過敏等作用,在食品中常作為一種甜味劑使用[1-4],但甘草酸分子極性較強(qiáng),不易穿透細(xì)胞膜,因而生物功效受到影響。單葡萄糖醛酸基甘草次酸[5-8](Glycyrrhetic acid 3-O-mono-β-D-glucuronide,GAMG)作為甘草酸衍生物,其分子極性適中,較易穿透細(xì)胞被人體充分吸收利用,并且甜度和安全性也更高[9-12]。所以GAMG被認(rèn)為是發(fā)揮甘草酸功效的最佳分子形態(tài)。由產(chǎn)紫青霉(PenicilliumpurpurogenumLi-3)[9]表達(dá)的β-葡萄糖醛酸苷酶能夠定向催化GL水解外端的一個(gè)葡萄糖醛酸基生成GAMG。

相比于化學(xué)法合成GAMG,生物法具有條件溫和、反應(yīng)速率高、能耗低、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)[13-18],是合成GAMG最佳選擇[19]。然而傳統(tǒng)游離微生物細(xì)胞在生物轉(zhuǎn)化過程中存在細(xì)胞重復(fù)利用率低、需菌量大、倒罐易染菌、對培養(yǎng)環(huán)境敏感等缺點(diǎn),微膠囊固定化細(xì)胞技術(shù)為游離細(xì)胞培養(yǎng)過程增強(qiáng)細(xì)胞逆境耐受能力、增加底物的轉(zhuǎn)化量、提高微生物全細(xì)胞催化的穩(wěn)定性和重復(fù)利用率提供技術(shù)保障。

關(guān)于固定化產(chǎn)紫青霉細(xì)胞的研究,葉海[20]等采用吸附法以聚氨酯泡沫固定化產(chǎn)紫青霉細(xì)胞,其優(yōu)點(diǎn)在于相比于游離細(xì)胞其催化周期縮短了一半,但是固定化細(xì)胞容易脫落,重復(fù)利用性差。曹紅[21]等利用殼聚糖-海藻酸鈣微膠囊制得了固芯微囊化產(chǎn)紫青霉細(xì)胞,固定化細(xì)胞的穩(wěn)定性和重復(fù)利用率得到提高。王彩霞[22]等研究硅藻土改性海藻酸鈣固芯微球固定化產(chǎn)紫青霉細(xì)胞,表明硅藻土能夠提高固定化細(xì)胞催化活力。蔡靜曉[23]等在制得殼聚糖-海藻酸鈣固芯微囊化產(chǎn)紫青霉細(xì)胞的基礎(chǔ)上,又研究了固芯液化技術(shù)對產(chǎn)紫青霉細(xì)胞使用性能的影響,結(jié)果顯示,液芯微囊化細(xì)胞在細(xì)胞的生長情況、傳質(zhì)性能和催化活性均優(yōu)于固芯,但制備步驟較繁瑣。為了進(jìn)一步簡化工藝,溫和反應(yīng)條件,增大微膠囊內(nèi)部細(xì)胞的生存空間,本文選用具有生物相容性的海藻酸鈉(SA)和羧甲基纖維素鈉(CMC)為囊材,采用兩步法制備液芯微膠囊,研究液芯微膠囊固定化產(chǎn)紫青霉細(xì)胞(簡稱液芯微囊化細(xì)胞)的制備條件及其催化性能,考察不同因素對微囊化細(xì)胞直徑、機(jī)械強(qiáng)度、破損率、催化性能的影響,為不斷提高產(chǎn)紫青霉全細(xì)胞生物催化劑在甘草酸生物轉(zhuǎn)化體系中的使用效率提供技術(shù)與方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

產(chǎn)紫青霉(PenicilliumpurpurogenumLi-3) 實(shí)驗(yàn)室保存菌種;甘草酸 新疆天山制藥廠,純度70%;氯化鈣 上海強(qiáng)順化學(xué)試劑有限公司,分析純;羧甲基纖維素鈉(分析純)、海藻酸鈉(化學(xué)純)、NaNO3(分析純)、K2HPO4(分析純)、MgSO4·7H2O(分析純)、KCl(分析純) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;產(chǎn)酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基:甘草酸 2.8 g·L-1,NaNO33.0 g·L-1,K2HPO40.8 g·L-1,MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1,KCl 0.5 g·L-1,FeSO4·7H2O 0.001 g·L-1,250 mL錐形瓶分裝100 mL,于120 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

BT101L型蠕動(dòng)泵 保定雷弗流體科技有限公司;B-011003型酸式滴定管 上海壘固儀器有限公司;AR323CN型電子天平 奧豪斯儀器(上海)有限公司;Agilent 640型紅外分光譜儀 美國安捷倫公司;THZ-C型恒溫振蕩器 太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;CRYODOS-50型凍干機(jī) 西班牙艾提艾斯科學(xué)醫(yī)藥公司;UltiMate-3000型高效液相色譜儀 美國Dionex公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 產(chǎn)紫青霉菌懸液的制備 配制產(chǎn)酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基,產(chǎn)紫青霉接種量5%,32 ℃ 150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)96 h后,離心(12000 r/min,10 min)棄上清收集菌體,0.9%的生理鹽水洗滌菌體,重懸,重復(fù)操作三次后用生理鹽水制成5000 mg/L的產(chǎn)紫青霉菌懸液,于4 ℃冰箱中保存。

1.2.2 微囊化產(chǎn)紫青霉細(xì)胞的制備 配制30 mL濃度為1.0% w/v的CMC與濃度為1.5% w/v的CaCl2的混合溶液,無菌條件下加入3% v/v菌懸液,磁力攪拌均勻?；旌弦航?jīng)蠕動(dòng)泵(120 r/min)勻速滴入經(jīng)磁力攪拌的100 mL 1.0% w/v的SA溶液后,迅速形成球狀微囊化細(xì)胞,滴加結(jié)束后攪拌5 min,用孔徑約1 mm漏網(wǎng)濾去SA溶液,無菌水沖洗三次微囊化細(xì)胞,濾紙吸干其表面水分,隨后置于100 mL的1% w/v的CaCl2溶液中靜置固化囊膜30 min,再經(jīng)無菌水沖洗三次,即得微囊化產(chǎn)紫青霉細(xì)胞,以上所需溶液除菌懸液均120 ℃高壓蒸汽滅菌20 min后冷卻至室溫使用。

1.2.3 微膠囊宏觀形態(tài)表征 按1.2.2實(shí)驗(yàn)方法制得微膠囊,將微膠囊分為三組,a:不做任何處理;b:冷凍干燥36 h;c:經(jīng)1.2.6.3中方法生物催化第1批次后回收的微囊化細(xì)胞,濾去培養(yǎng)基,經(jīng)去離子水沖洗;用普通相機(jī)分別對三組拍照。

1.2.4 紅外分析(FT-IR)分析 樣品充分干燥后,取少量樣品與KBr混合,研細(xì)、壓片,光譜掃描范圍4400～400 cm-1,掃描速度中速,掃描16次。

1.2.5 不同因素對微囊化細(xì)胞的影響 分別對CMC濃度、SA濃度、滴注液中CaCl2濃度、固化過程CaCl2濃度、加菌量進(jìn)行優(yōu)化,各因素優(yōu)化條件如表1所示,其余按照1.2.2項(xiàng)下的方法與條件制備微囊化細(xì)胞,以各因素對微囊化細(xì)胞直徑、機(jī)械強(qiáng)度、破損率及催化特性的影響為考察指標(biāo),各因素在前一因素最佳水平下逐級優(yōu)化。

表1 各因素優(yōu)化條件Table 1 Optimization conditions of various factors

1.2.6 指標(biāo)測定

1.2.6.2 微囊化產(chǎn)紫青霉細(xì)胞物理機(jī)械強(qiáng)度的測定 采用單軸按壓法[25]測定微囊化產(chǎn)紫青霉細(xì)胞機(jī)械強(qiáng)度,用藥匙在電子天平上按壓微囊化細(xì)胞,臨界破裂時(shí)電子天平最大讀數(shù)表示其機(jī)械強(qiáng)度,測量30粒微囊化細(xì)胞,取平均值。

色譜分析條件:戴安UltiMate-3000,色譜柱:InertSustain C18,ODS(250 mm×4.6 mm i.d.,5 μm),檢測器:SPD,工作站:LCsoLution,檢測波長:254 nm,柱溫箱:30 ℃,進(jìn)樣量:20 μL,流速:0.7 mL/min,流動(dòng)相:甲醇:重蒸水(加入適量醋酸,pH3.0)=81∶19。

1.2.7 微囊化產(chǎn)紫青霉細(xì)胞重復(fù)利用 微囊化細(xì)胞按1.2.6.3培養(yǎng),每批次培養(yǎng)終點(diǎn)取樣檢測GAMG濃度,取出微囊化細(xì)胞無菌水沖洗三次,加入到新配產(chǎn)酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基,進(jìn)行重復(fù)利用催化反應(yīng),以微囊化細(xì)胞相對活性(%)=每批次生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束時(shí)GAMG產(chǎn)率/第1批次生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束時(shí)GAMG產(chǎn)率×100計(jì)算。

1.3 數(shù)據(jù)處理

微囊化細(xì)胞直徑、破損率、催化特性、重復(fù)利用性均平行測量三次,機(jī)械強(qiáng)度平行測量30次,數(shù)據(jù)差異顯著性分析采用SPSS 17.0軟件,應(yīng)用Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 微膠囊宏觀形態(tài)分析

由圖1可知,CMC與SA制備的是透光性良好的微膠囊(a),微膠囊球形度良好且表面光滑;冷凍干燥后的微膠囊(b),部分保持了球狀,部分癟皺,說明微膠囊具有一定抗收縮能力[26]。生物催化后的微囊化細(xì)胞(c),可以清晰看出微囊化產(chǎn)紫青霉細(xì)胞形態(tài)完整,晶瑩通透,肉眼可見囊內(nèi)菌絲,說明此微囊化環(huán)境對產(chǎn)紫青霉具有良好生物相容性。

圖1 微膠囊及微囊化細(xì)胞的外觀Fig.1 The appearance of microencapsule and microencapsulted cells注:a:微膠囊;b:凍干微膠囊;c:生物催化第1批次后,回收的微囊化細(xì)胞;“”代表比例尺為5 mm。

2.2 微膠囊樣品紅外分析

圖2為不同樣品的紅外光譜圖,從圖2a可以看出樣品CMC具有典型的特征峰,其中3424 cm-1是-OH伸縮振動(dòng),2923 cm-1是-CH2不對稱伸縮振動(dòng),1615、1425 cm-1分別是-COO-的不對稱伸縮振動(dòng)峰和對稱伸縮振動(dòng)峰,1055 cm-1為伯醇C-O伸縮振動(dòng)峰,1115 cm-1為CMC的醚鍵O-C-O。對比樣品a、b,峰位置一致,紅外分析結(jié)果表明CMC與氯化鈣混合物可能僅僅發(fā)生物理共混,即CMC為Ca2+的增稠劑[27]。從圖2c可見,樣品SA在1300 cm-1處為C-C-H和O-C-H伸縮振動(dòng)峰,1030 cm-1是由C-O-C伸縮振動(dòng)引起[28]。圖2d為SA與CaCl2混合物紅外圖譜,2923 cm-1處是環(huán)上的-CH伸縮振動(dòng),峰強(qiáng)度降低,是因?yàn)楹Ｔ逅徕}的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)限制了六元環(huán)上-CH的伸縮振動(dòng),945 cm-1峰消失,882 cm-1峰減弱,說明部分羥基氧參與了配位反應(yīng),O-H的鍵能降低[29]。對比樣品c、d紅外圖譜,說明SA與Ca2+發(fā)生了交聯(lián)作用。樣品e與a、b、c、d紅外圖譜對照可知,形成的微膠囊結(jié)構(gòu)類似SA與Ca2+混合物。

圖2 微膠囊樣品紅外圖譜Fig.2 The infrared spectrum of microcapsule 注:a:CMC;b:CMC和CaCl2混合物;c:SA;d:SA和CaCl2混合物;e:微膠囊。

2.3 微囊化產(chǎn)紫青霉細(xì)胞工藝研究

2.3.1 滴注液中CMC濃度對微囊化細(xì)胞的影響 由圖3a可知,隨著CMC濃度增大,微囊化細(xì)胞直徑明顯減小,這是因?yàn)镃MC濃度較低時(shí),其粘度較低,對Ca2+的束縛能力較弱,Ca2+迅速向外擴(kuò)散,與SA結(jié)合形成直徑較大的微囊化細(xì)胞。當(dāng)CMC濃度增大,芯材粘度增大,對Ca2+束縛的能力增強(qiáng),Ca2+向外擴(kuò)散速率降低,與SA結(jié)合形成直徑較小的微囊化細(xì)胞。由圖3b可知,隨著CMC濃度增大,微囊化細(xì)胞的機(jī)械強(qiáng)度先增大后減小。機(jī)械強(qiáng)度先增大,是因?yàn)镃MC粘度增大,對保持微囊化細(xì)胞形態(tài)具有一定支撐作用,增強(qiáng)了微囊化細(xì)胞的抗壓能力、柔韌性,故破損率也較小,而當(dāng)CMC粘度過大時(shí),根據(jù)斯托克斯-愛因斯坦[30](Stocks-Einstein)方程(Dt=TKB/3πηd),溶液粘度η越大,擴(kuò)散系數(shù)Dt越小,Ca2+向外擴(kuò)散能力減弱,CMC對Ca2+的束縛作用加強(qiáng),減少了SA與Ca2+的結(jié)合,囊膜的抗壓能力減弱,破損率略上升;當(dāng)CMC濃度為1.4%時(shí)破損率差異性顯著(p<0.05),微囊化細(xì)胞具有較好的機(jī)械強(qiáng)度,而囊膜的抗壓能力也較好,破損率最小。GAMG產(chǎn)率先增加后減小,這是由于CMC濃度增大,微囊化細(xì)胞的機(jī)械強(qiáng)度增加,破損率減小,產(chǎn)率增加;當(dāng)CMC濃度過高,芯材粘度較大,會(huì)阻礙GL與GAMG在微囊化細(xì)胞中的擴(kuò)散,使得GAMG產(chǎn)率降低。綜上所述,CMC濃度為1.4%最佳。

圖3 CMC濃度對細(xì)胞微囊化效果的影響Fig.3 Effect of the concentration of CMCon the microencapsulated cells注:同一指標(biāo)字母相同,表示差異不顯著(p>0.05), 字母不相同,表示差異顯著(p<0.05);圖4～圖7同。

2.3.2 SA濃度對微囊化細(xì)胞的影響 如圖4a,隨著SA濃度增大,微囊化細(xì)胞的直徑逐漸減小,這是因?yàn)镃a2+濃度固定時(shí),SA濃度增大,Ca2+來不及向外擴(kuò)散即與SA位點(diǎn)結(jié)合,SA濃度越大,Ca2+向外擴(kuò)散距離越短,故形成的微囊化細(xì)胞直徑越小。由圖4b可知,隨SA濃度增大,微囊化細(xì)胞的機(jī)械強(qiáng)度增大,破損率逐漸減小,這是因?yàn)镾A濃度增大,Ca2+與SA位點(diǎn)結(jié)合越致密,微囊化細(xì)胞抗壓能力增大,抗流體剪切能力增大。GAMG產(chǎn)率先增加后減小,是因?yàn)镾A濃度低時(shí),Ca2+與SA結(jié)合較疏松,利于底物的傳入和產(chǎn)物傳出,因此GAMG產(chǎn)率較大,而當(dāng)SA濃度過大時(shí),微囊化細(xì)胞結(jié)構(gòu)致密,不利于產(chǎn)物與底物的擴(kuò)散,進(jìn)而導(dǎo)致了GAMG產(chǎn)率的減小。因此選用SA濃度為1.2%。

圖4 SA濃度對細(xì)胞微囊化效果的影響Fig.4 Effect of the concentration of SA on the microencapsulated cells

2.3.3 滴注液中CaCl2濃度對微囊化細(xì)胞的影響 由圖5a可知,隨著CaCl2的濃度增加,微囊化細(xì)胞直徑逐漸增大,是因?yàn)镃a2+濃度增大,由于濃度梯度推動(dòng)力,Ca2+向外擴(kuò)散能力增強(qiáng),與SA結(jié)合形成較大直徑的微囊化細(xì)胞[27]。圖5b中微囊化細(xì)胞的機(jī)械強(qiáng)度先增大后持平,破損率先降低保持不變,這是由于CaCl2的濃度越大,SA與Ca2+凝膠結(jié)構(gòu)越來越緊密,當(dāng)Ca2+濃度恰好與濃度為1.2%的SA充分結(jié)合,則機(jī)械強(qiáng)度無法繼續(xù)增大。GAMG的產(chǎn)率先增大后減小,當(dāng)CaCl2的濃度為1.0%時(shí),GAMG的產(chǎn)率最高,這是由于CaCl2的濃度較小時(shí),CaCl2與SA所形成的凝膠結(jié)構(gòu)較疏松,其表面包覆的多余的SA,則導(dǎo)致微囊化細(xì)胞表面通孔結(jié)構(gòu)被堵塞,GAMG產(chǎn)率較小;當(dāng)CaCl2的濃度越高時(shí),SA與Ca2+結(jié)合越致密,傳質(zhì)受阻,導(dǎo)致了GAMG產(chǎn)率減小。在保證一定物理機(jī)械強(qiáng)度下,以GAMG產(chǎn)率最大化為優(yōu)先,選擇CaCl2濃度為1.0%。

圖5 CaCl2濃度對細(xì)胞微囊化效果的影響Fig.5 Effect of the concentration of CaCl2on the microencapsulated cells

2.3.4 固化過程CaCl2溶液濃度對微囊化細(xì)胞的影響 固化囊膜過程是在微囊化細(xì)胞成形后,將微囊化細(xì)胞置于低于成囊CaCl2濃度的Ca2+溶液中,低濃度Ca2+可以從微膠囊外表面由外向內(nèi)擴(kuò)散,相比未固化的微囊化細(xì)胞,固化的微囊化細(xì)胞直徑明顯變小,隨著固化過程CaCl2濃度增大,直徑越來越小(見圖6a)。這是由于成囊過程中較高濃度Ca2+滴入SA后,Ca2+向外擴(kuò)散與SA位點(diǎn)結(jié)合,Ca2+擴(kuò)散平衡后,微囊外層仍有較多SA,囊膜層也較厚,而放置在低濃度的Ca2+溶液,Ca2+由外向內(nèi)擴(kuò)散與微囊化細(xì)胞外層SA空缺位點(diǎn)結(jié)合,結(jié)構(gòu)變得更加致密,因而直徑逐漸減小。由圖6b可知,固化過程CaCl2濃度對微囊化細(xì)胞的機(jī)械強(qiáng)度影響最大,破損率從54.0%降至0,機(jī)械強(qiáng)度也迅速增大。這是由于固化過程CaCl2濃度越大,更能充分與SA結(jié)合,使微膠囊囊膜結(jié)構(gòu)更加致密,因而機(jī)械強(qiáng)度較大。固化過程CaCl2濃度增大,GAMG產(chǎn)率先增加后迅速減小,是因?yàn)楣袒^程CaCl2濃度較低時(shí),Ca2+與SA形成的凝膠結(jié)構(gòu)疏松,利于傳質(zhì),而當(dāng)固化過程CaCl2濃度增大,微囊化細(xì)胞結(jié)構(gòu)致密,傳質(zhì)受阻較大,甚至底物較難傳遞到囊膜內(nèi),細(xì)胞因缺乏營養(yǎng)而生長代謝過程受阻,故GAMG降低。綜上所述,固化囊膜過程CaCl2的濃度選擇0.5%，此時(shí)GAMG產(chǎn)率最高、具有一定機(jī)械強(qiáng)度。

圖6 固化過程CaCl2濃度對細(xì)胞微囊化效果的影響Fig.6 Effect of the concentration of the post cured CaCl2 on the microencapsulated cells

2.3.5 滴注液中加菌量對微囊化細(xì)胞的影響 由圖7a可以看出,加菌量增加,微囊化細(xì)胞直徑先增大后減小,加菌量為3.0%時(shí)差異性顯著(p<0.05),直徑最大。加入2.0%菌體,芯材粘度稍大,細(xì)胞直徑較小,而菌體含量超過3.0%且繼續(xù)增加時(shí),對芯材有稀釋作用,Ca2+濃度降低,Ca2+向外擴(kuò)散能力減弱,微囊化細(xì)胞直徑減小。圖7b中,隨著加菌量增加,機(jī)械強(qiáng)度先增大后減小,機(jī)械強(qiáng)度增大,是因?yàn)榧尤肷倭烤w,降低了芯材的粘度,促進(jìn)了Ca2+與SA的結(jié)合,使機(jī)械強(qiáng)度增大,而加菌量越多,對Ca2+的稀釋作用越大,能與SA結(jié)合Ca2+相應(yīng)減少,從而降低了微膠囊結(jié)構(gòu)的致密性,導(dǎo)致機(jī)械強(qiáng)度越來越小。隨著加菌量增加,GAMG的產(chǎn)率先增大后減小,當(dāng)加菌量為3.0%時(shí),GAMG的產(chǎn)率最大。這是由于當(dāng)加菌量過低時(shí),微膠囊包埋的菌體量少,GAMG的產(chǎn)率不高;當(dāng)加菌量增加時(shí),微膠囊包埋的菌體量增加,形成了細(xì)胞團(tuán)聚纏繞,細(xì)胞團(tuán)內(nèi)部的供氧困難,造成中心細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn)壞死現(xiàn)象[31],GAMG的產(chǎn)率降低。綜上所述,選擇加菌量為3.0%。

圖7 加菌量對細(xì)胞微囊化效果的影響Fig.7 Effect of the concentration of cells on the microencapsulated cells

2.3.6 微囊化細(xì)胞重復(fù)利用 在最優(yōu)條件下制備微囊化產(chǎn)紫青霉細(xì)胞進(jìn)行重復(fù)利用實(shí)驗(yàn),如圖8所示,隨著使用批次的增加,微囊化細(xì)胞的相對活性逐漸降低,但重復(fù)使用9次后微囊化細(xì)胞相對活性仍能達(dá)到56.9%。

圖8 微囊化細(xì)胞重復(fù)使用Fig.8 Repeated use of microencapsulated cells

3 結(jié)論

以SA與CMC制備的微囊化產(chǎn)紫青霉細(xì)胞為載體,表征發(fā)現(xiàn)微膠囊表面平整,微膠囊的紅外圖譜表明樣品為SA與CaCl2的混合物,可見SA與Ca2+發(fā)生交聯(lián)作用形成了微膠囊,以微囊化細(xì)胞的直徑、機(jī)械強(qiáng)度、破損率及催化特性為考察指標(biāo),優(yōu)化微膠囊制備條件,最優(yōu)制備條件為:羧甲基纖維素鈉的濃度為1.4%,海藻酸鈉的濃度為1.2%,CaCl2的濃度為1.0%,固化囊膜過程CaCl2濃度為0.5%,加菌量為3.0%,此條件下,微囊化細(xì)胞重復(fù)利用9次后,相對活性達(dá)到56.9%,具有較好的重復(fù)利用性能。