火龍果花的體外抗氧化物提取工藝優(yōu)化及其抗炎活性

張艷軍,廖日權(quán),鄭云云,尹艷鎮(zhèn),黃秋園,徐國(guó)鑫,黃恩交,朱靖清,吳彩麗

(欽州學(xué)院石油與化工學(xué)院,廣西高校北部灣石油天然氣資源有效利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西欽州 535011)

火龍果(Pitaya)是仙人掌科,三角柱屬植物[1]。火龍果花包含了人體必需的氨基酸、維生素、微量元素、膳食纖維、蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸等多種營(yíng)養(yǎng)成分,且其藥用成分廣泛,主要含黃酮、萜類、多酚類等活性物質(zhì)[2-4]?；瘕埞ㄖ刑赜械恼骋?富含營(yíng)養(yǎng),具有較高藥用價(jià)值,能起到抑菌、消炎、清火、潤(rùn)肺、止咳、增強(qiáng)免疫力、降血糖、降血脂、降血壓、抗癌、治療高尿酸癥等作用[5-7]。

近年來,學(xué)者們對(duì)火龍果花的研究較多,主要涉及火龍果花的干制[8]、保健飲料的制作[9]、營(yíng)養(yǎng)成分的研究等[2]方面。周俊良等[10]以脫水火龍果花為原料,研制出蜂蜜火龍果花茶飲料的最佳配比工藝,在此條件下該茶飲料的感官評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)高,滿足大眾口味。高慧穎等[11]探討超聲波輔助提取火龍果花多糖的工藝條件,多糖抗氧化活性的結(jié)果顯示，其具有較強(qiáng)的抗氧化活性。王琦等[12]探索了不同粉碎度、有機(jī)溶劑、溫度以及提取時(shí)間對(duì)火龍果花精油提取率的影響,確立了火龍果花精油的最佳提取工藝條件。火龍果花因在藥食兩方面的廣泛用途，具有較大的開發(fā)前景,而目前對(duì)火龍果花的體外抗氧化物提取工藝及抗炎活性的研究未見報(bào)道。

本文以火龍果花為研究對(duì)象,以乙醇為溶劑,先進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),在此基礎(chǔ)上采用正交試驗(yàn)進(jìn)行火龍果花體外抗氧化物提取工藝優(yōu)化,尋求最佳的提取工藝條件;并對(duì)最佳工藝條件下的粗提物進(jìn)行了體外抗炎活性研究。該研究旨在為火龍果花的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)和提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

火龍果干花 粉碎后過80目篩,至于干燥器中備用,廣西欽州市火龍果基地,粉碎,過80目篩,備用;DPPH(即二苯代苦味酰肼)、VC、LPS(脂多糖)、胰酶、MTT(噻唑藍(lán)) 美國(guó)Sigma公司;Hyclone DMEM培養(yǎng)基、血清 美國(guó)Gibco公司;RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞 中科院上海生命研究院;NO檢測(cè)試劑盒(Griess試劑Ⅰ和Griess試劑Ⅱ) 碧云天生物技術(shù)有限公司;乙醇、FeSO4、水楊酸、過氧化氫等 均為分析純。

T6型可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;FB214C型電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司;M1000型多功能酶標(biāo)儀 瑞士tecan公司;311型CO2培養(yǎng)箱 美國(guó)Thermo公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取工藝 準(zhǔn)確稱量火龍果花約2.0 g,在一定的溫度、液料比和一定濃度的乙醇中，回流提取一定的時(shí)間,磁力攪拌輔助,回流完成后趁熱抽濾,將濾液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中,并用同濃度乙醇定容,得到的待測(cè)樣品進(jìn)行下一步的抗氧化活性測(cè)定。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 提取溫度對(duì)火龍果花提取物體外抗氧化活性的影響:預(yù)先設(shè)定料液比為1∶25 g/mL,乙醇濃度為75%,回流時(shí)間2 h,通過改變提取溫度,分別設(shè)定為45、55、65、75、85 ℃五個(gè)水平，來探究提取溫度對(duì)火龍果花提取液抗氧化活性的影響。料液比對(duì)火龍果花提取物體外抗氧化活性的影響:設(shè)定提取溫度75 ℃,乙醇濃度為75%,回流時(shí)間2h,通過改變料液比,分別設(shè)定為1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 g/mL五個(gè)水平，來探究料液比對(duì)火龍果花提取液體外抗氧化活性的影響。提取時(shí)間對(duì)火龍果花提取物體外抗氧化活性的影響:設(shè)定溫度75 ℃和液料比1∶30 g/mL,乙醇濃度為75%,通過改變回流時(shí)間,分別設(shè)定為1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h五個(gè)水平，來探究提取時(shí)間對(duì)火龍果花提取液抗氧化活性的影響。溶劑乙醇濃度對(duì)火龍果花提取物體外抗氧化活性的影響:設(shè)定溫度75 ℃,液料比1∶30 g/mL和時(shí)間3.0 h,通過改變?nèi)軇┮掖紳舛?分別設(shè)定為60%、70%、80%、90%、100%五個(gè)水平來探究溶劑乙醇濃度對(duì)火龍果花提取液體外抗氧化活性的影響。

1.2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)火龍果花體外抗氧化活性單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,對(duì)影響火龍果花抗氧化活性的四個(gè)因素(提取溫度A,提取時(shí)間B,料液比C,乙醇濃度D)采用正交試驗(yàn)法優(yōu)化提取工藝,采用L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn),因素水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal test

1.2.4 體外抗氧化實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 DPPH自由基清除率的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[13],取待測(cè)樣品各2 mL,分別加入2 mL 1.0×10-4mol/L DPPH,搖勻后暗室存放,30 min后,在517 nm測(cè)溶液的吸光值,并用空白液進(jìn)行參比。每份樣品平行測(cè)定3次取平均值。由所測(cè)得的吸光度值,計(jì)算出各待測(cè)樣品對(duì)DPPH自由基的清除率K1,即用下式計(jì)算:

清除率K1(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100

式中:Ai-DPPH溶液和待測(cè)溶液吸光度;Aj-待測(cè)溶液和溶劑吸光度;A0-DPPH溶液和溶劑的吸光度。

1.2.4.2 OH自由基清除率的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[14],待測(cè)樣品各2 mL,加入6 mmol/L硫酸亞鐵2 ml,再加入6 mmol/L水楊酸-乙醇2 mL,最后加入6 mmol/L的過氧化氫溶液2 mL,搖勻后水浴37 ℃,0.5 h,在510 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)1。以等體積水代替水楊酸-乙醇溶液,測(cè)定吸光值A(chǔ)2,以扣除樣品本身顏色干擾,以等體積水代替樣品,為空白樣,測(cè)定吸光值A(chǔ)0,每份樣品平行測(cè)定3次,取平均值。由所測(cè)得的吸光度值,計(jì)算出各待測(cè)樣品對(duì)OH自由基的清除率K2,即用下式計(jì)算:

清除率K2(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

式中:A1-樣品+硫酸亞鐵+水楊酸-乙醇+過氧化氫的吸光度;A2-樣品+硫酸亞鐵+蒸餾水+過氧化氫的吸光度的吸光度;A0-蒸餾水+硫酸亞鐵+水楊酸-乙醇+過氧化氫的吸光度。

1.2.4.3 樣品對(duì)自由基的半清除濃度(IC50)測(cè)定 在最佳工藝條件下,回流提取樣品后,將樣品減壓濃縮,置于真空干燥箱烘干。將樣品配制成濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL,以不同濃度的VC為陽(yáng)性對(duì)照，分別測(cè)定其對(duì)DPPH自由基與OH自由基的清除率,計(jì)算其半清除濃度。

1.2.5 體外抗炎活性測(cè)試

1.2.5.1 不同濃度樣品對(duì)細(xì)胞活力影響 根據(jù)MTT法[15-16],選取了2.5、5.0、10.0、20.0 μg/mL四個(gè)濃度各10 mL,判斷這四個(gè)劑量組以及100 ng/mL LPS(脂多糖)處理對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7活力影響,設(shè)定未加藥(加入DMEM培養(yǎng)基)正常組細(xì)胞活力為100%。

1.2.5.2 不同濃度樣品對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞中NO含量的影響 利用griess法[17],將密度為2×106個(gè)/mL的RAW264.7巨噬細(xì)胞，以每孔180 μL均勻接種于96孔板中,細(xì)胞貼壁2 h后,每孔分別加入10 μL 2 μg/mL LPS,4 h后加入10 μL 2.5、5.0、10.0、20.0 μg/mL粗提物,設(shè)LPS對(duì)照和空白對(duì)照,每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔,培養(yǎng)24 h后取培養(yǎng)液上清于96 孔板中,按50 μL/孔,在各孔中室溫加入Griess試劑Ⅰ和Griess 試劑Ⅱ,標(biāo)準(zhǔn)品用DMEM 稀釋,濃度分別為0.00、1.56、3.12、6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 μmol/L,以10% DMEM加顯色劑為空白對(duì)照,在540 nm酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度值,以NaNO2為標(biāo)準(zhǔn)品,按標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程求出待測(cè)樣品中NO濃度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft excel 2017,Origin Pro 8,SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,單因素試驗(yàn)和抗氧化、抗炎活性測(cè)定均重復(fù)3次,取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取溫度對(duì)火龍果花提取物抗氧化活性的影響 由圖1可知,提取溫度對(duì)DPPH自由基及OH自由基的清除率都有著一定的影響,在溫度為45～75 ℃時(shí),提取液對(duì)DPPH自由基和OH自由基清除率隨溫度的上升而增加,但超過75 ℃后,清除率隨溫度的上升而減小,這可能是因?yàn)?，過高的溫度會(huì)使火龍果花中抗氧化活性成分多酚、花青素、多糖等的結(jié)構(gòu)被破壞[18],從而使提取物對(duì)DPPH自由基和OH自由基的清除率減小。綜上可知,75 ℃下提取時(shí)提取物對(duì)自由基的清除能力最強(qiáng)。

圖1 提取溫度對(duì)DPPH和OH自由基清除率的影響Fig.1 Effects of extracting temperature on the DPPH and OH radical-scavenging

2.1.2 料液比對(duì)火龍果花提取物抗氧化活性的影響 由圖2可看出,樣品和溶劑在不同的比例下,對(duì)DPPH自由基清除率及OH自由基的清除率影響也不同,且在料液比為1∶20～1∶30 g/mL范圍內(nèi),清除率隨料液比的增加而上升,這是由于，隨著提取溶液的增多,樣品在溶液中的分散程度增大,提取物與溶劑的接觸面積增大,有利于火龍果花中抗氧化活性成分能充分溶出。但超過1∶30 g/mL后,清除率變化不大,這可能是由于達(dá)到一定的料液比時(shí),火龍果花提取液中的抗氧化活性成分多糖、黃酮等基本溶解完全,溶劑量繼續(xù)增加,抗氧化活性成也不會(huì)再有所增加,考慮到實(shí)驗(yàn)過程中原料的經(jīng)濟(jì)性與實(shí)驗(yàn)的效率,選定料液比在1∶30 g/mL為最佳。

圖2 料液比對(duì)DPPH和OH自由基清除率的影響Fig.2 Effects of solid-liquid ratio on the DPPH and OH radical scavenging rate

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)火龍果花提取物抗氧化活性的影響 由圖3可知,在熱回流法提取火龍果花體外抗氧化性的實(shí)驗(yàn)中,提取的時(shí)間對(duì)清除率有影響,且呈這樣一個(gè)規(guī)律:提取時(shí)間1.0～3.0 h時(shí),提取液對(duì)DPPH自由基和OH自由基的清除率都呈上升趨勢(shì),而超過3.0 h后,清除率呈下降趨勢(shì),這可能是因?yàn)?，火龍果花提取液中的抗氧化活性成分在一定時(shí)間、溫度下與溶劑充分接觸，基本已經(jīng)溶解完全,繼續(xù)增加時(shí)間,反而會(huì)使得某些成分被破壞[19]。因此,提取時(shí)間設(shè)定在3.0 h,提取效果最佳,提取液清除自由基能力最強(qiáng)。

圖3 提取時(shí)間對(duì)DPPH和OH自由基清除率的影響Fig.3 Effects of extracting time on the DPPH and OH radical scavenging rate

2.1.4 溶劑濃度對(duì)火龍果花提取物抗氧化活性的影響 由圖4可知,提取溶劑的濃度對(duì)自由基的清除率影響趨勢(shì)是:當(dāng)乙醇濃度為60%～70%范圍時(shí),清除率呈逐漸上升的趨勢(shì),但當(dāng)乙醇濃度繼續(xù)增加時(shí),提取液最自由基的清除率反而下降,這可能是由于高濃度的乙醇極性偏小,會(huì)使火龍果花中的蛋白、多糖等極性稍大的成分凝固而不能溶解,或者一些酚類不能被溶出[20],抗氧化活性成分的溶解度變低,導(dǎo)致提取物與對(duì)自由基的清除率能力下降。故設(shè)定70%的乙醇濃度為最佳條件。

圖4 乙醇濃度對(duì)DPPH和OH自由基清除率的影響Fig.4 Effects of ethanol concentrationon the DPPH and OH radical scavenging rate

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及驗(yàn)證

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,按L9(34)進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)(見表2)。

表2 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 L9(34)orthogonal test design and results

本實(shí)驗(yàn)研究了提取溫度、提取時(shí)間、料液比以及乙醇濃度四個(gè)因素對(duì)火龍果花提取物體外抗氧化活性的影響,由正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果中極差分析得,影響火龍果花提取的因素主次順序?yàn)镈>C>A>B,即乙醇濃度對(duì)結(jié)果影響最大,其次是料液比,接著是提取溫度,提取時(shí)間的影響最小。根據(jù)L9(34)正交實(shí)驗(yàn)確定出最佳提取工藝條件為A2B2C2D2,即提取溫度為75 ℃、提取時(shí)間為3.0 h、料液比為1∶30 g/mL、溶劑乙醇濃度為70%,在最佳提取工藝下所測(cè)得的DPPH自由基清除率達(dá)到86.40%±1.07%,OH自由基的清除率達(dá)到83.50%±0.52%。

2.3 最佳提取工藝條件下樣品對(duì)自由基的半清除濃度(IC50)

在最佳工藝條件下所得樣品,由圖5和圖6可知,樣品與VC對(duì)自由基的清除能力隨著樣品濃度的增加而增大,計(jì)算其對(duì)自由基的半清除濃度。結(jié)果表明:樣品對(duì)DPPH自由基的清除曲線方程:y=185.17x-0.493,R2=0.9985,IC50值為0.273 mg/mL,VC對(duì)DPPH自由基:y=790.62x+17.12,R2=0.9974,IC50值為0.0416 mg/mL;樣品對(duì)OH自由基的清除曲線方程:y=178.27x-0.132,R2=0.9974,IC50值為0.288 mg/mL。VC對(duì)OH自由基的清除曲線方程:y=140.94x-0.877,R2=0.9986,IC50值為0.361 mg/mL。綜上所述,樣品對(duì)DPPH自由基的清除率低于VC,而樣品對(duì)OH自由基的清除率高于VC。

圖5 樣品濃度對(duì)DPPH自由基清除能力的影響Fig.5 Effect of sample concentration on DPPH· radical scavenging ability

圖6 樣品濃度OH自由基的清除能力的影響Fig.6 Effect of sample concentration on OH radical scavenging ability

2.4 最佳提取工藝條件下體外抗炎活性測(cè)定結(jié)果

2.4.1 不同濃度的樣品對(duì)細(xì)胞活力的影響 由圖7試驗(yàn)結(jié)果表明,與正常組相比,選取的四個(gè)劑量組以及LPS的加入對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力也無顯著差異(p>0.05)。證明在實(shí)驗(yàn)設(shè)置的藥物劑量下,設(shè)定濃度的樣品沒有細(xì)胞毒性。

圖7 粗提物濃度對(duì)細(xì)胞活力的影響Fig.7 Effect of extract concentration on cell viability注:a表示組間差異不顯著(p>0.05,n=3)。

2.4.2 粗提物對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞中NO的作用 從圖8中可見,相較于正常組,LPS作用后的RAW264.7巨噬細(xì)胞中NO含量極顯著增大(p<0.01);相較于LPS組,粗提物可極顯著抑制NO的釋放(p<0.01),且濃度越大,化合物對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO的抑制作用越強(qiáng)。表明化合物通過抑制NO的釋放表現(xiàn)出來的抗炎活性與濃度呈正相關(guān),具有劑量依賴性,得抑制率與樣品濃度曲線方程:y=2.502x+15.15,R2=0.980(x為樣品濃度，μg/mL；y對(duì)NO的抑制率，%),算得粗提物對(duì)NO的半抑制濃度IC50為13.94 μg/mL。

圖8 粗提物濃度對(duì)細(xì)胞中NO的影響Fig.8 Effect extract concentration on NO in cell 注:不同大寫字母表示組間差異極顯著(p<0.01,n=3)。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)火龍果花粗提物體外抗氧化活性工藝及抗炎進(jìn)行了初步探究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:在70%乙醇,1∶30 g/mL料液比,提取溫度75 ℃,3.0 h熱回流為最佳提取條件,此條件下粗提物對(duì)DPPH自由基的IC50值為0.273 mg/mL,OH自由基的IC50值為0.288 mg/mL。最佳工藝條件下提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的NO有很強(qiáng)的抑制作用,且與濃度呈正相關(guān),具有劑量依賴性,其半抑制濃度IC50值為13.94 μg/mL,可見火龍果花具有較好的體外抗氧化和抗炎活性。有關(guān)資料顯示火龍果花中含有豐富的多糖、黃酮和黃酮醇、三萜類化合物等活性物質(zhì)[2,21],這些物質(zhì)涉及抗氧化[11]、抗炎[22]等功效與本研究結(jié)果一致。該研究為拓寬火龍果花綜合利用途徑奠定基礎(chǔ)和提供理論依據(jù)，為火龍果花的藥用成分的進(jìn)一步研究提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù),為火龍果花資源的開發(fā)利用打下基礎(chǔ)。