孝感米酒中乳酸菌的分離及其對黃酒品質(zhì)的影響

楊小麗,高 航,徐寶釵,趙慧君,馬佳佳,張振東

(湖北文理學(xué)院食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所,湖北襄陽 441053)

黃酒是世界三大釀造酒之一,擁有數(shù)千年的歷史。在國內(nèi)多個省份,人們都能以稻米或者糯米為主要原料,經(jīng)過蒸料后加入酒藥及酒母作為發(fā)酵劑,經(jīng)糖化發(fā)酵作用釀制出酒精含量8%～16%的黃酒。黃酒主要流行于我國南方地區(qū),特別是浙江與福建地區(qū)尤盛。黃酒具有很多保健功效,如抗氧化,降血壓、降血脂和降膽固醇,另外由于黃酒香濃、味醇的特點,深受人們喜愛[1-2]。

乳酸菌對傳統(tǒng)發(fā)酵食品的風(fēng)味形成與品質(zhì)穩(wěn)定起到重要作用。多項研究表明,黃酒發(fā)酵環(huán)境中存在著豐富的乳酸菌[3-4]。黃酒的釀造離不開乳酸菌的參與:由乳酸代謝產(chǎn)生的乳酸等有機酸與酵母發(fā)酵生成的乙醇經(jīng)酯化反應(yīng)生成乳酸乙酯等酯類,酯類含量的多少在一定程度上決定了黃酒的風(fēng)味,因此乳酸菌的代謝作用提高了黃酒風(fēng)味的復(fù)雜性[2,5]。對米酒發(fā)酵劑及黃酒發(fā)酵劑中的微生物研究表明,乳酸菌在占有較大比例,然而目前對利用乳酸菌改進黃酒品質(zhì)的報道仍然較少,對黃酒源乳酸菌的開發(fā)與利用有待于加強。

黃酒與米酒原料類似,而發(fā)酵工藝卻存在較大差異,但是不少研究人員從黃酒與米酒環(huán)境中獲得了乳酸菌資源。因此,本研究從孝感民間釀制的米酒中對乳酸菌進行了分離,并在黃酒發(fā)酵起始時,將分離到的乳酸菌作為發(fā)酵劑接入到黃酒中以評價獲得的乳酸菌分離菌株對黃酒品質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米酒樣品 采集于湖北省孝感市農(nóng)戶家庭;MRS培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司;Axygen PCR清潔試劑盒 康寧生命科學(xué)吳江有限公司;DL2000 Marker、PCR buffer、rTaq DNA聚合酶、pMD18-T克隆載體 寶生物工程(大連)有限公司;Escherichiacolitop10 實驗室保存;引物27F與1492R 天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成;糯米 襄陽市鑫源超市;麥曲 襄陽市臥龍鎮(zhèn)農(nóng)貿(mào)市場用;酒母 麗水力克生物科技有限公司;甘油、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、鹽酸、正磷酸、草酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸、蘋果酸、乳酸、乙酸 分析純，上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司;0.45 μm濾頭(水系) 上海安普生物科技有限公司;電子舌滋味測定用的參比溶液、內(nèi)部溶液、外部溶液 日本Insent公司。

HR40-ⅡB2型生物安全柜 青島海爾中國;QYC-2102C全溫培養(yǎng)搖床 上海新苗;SA402B味覺分析系統(tǒng) 日本INSENT公司;LC-20ADXR液相色譜儀 日本Shimadzu公司;PTC-100PCR儀 美國ABI公司;Fluor Chem FC3化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng) 美國ProteinSimple公司;Abbemat 350全自動折光儀 奧地利安東帕公司;SW-CJ-2D雙人單面凈化工作臺 蘇州安泰;XFS-280手提式壓力蒸汽滅菌鍋 浙江新豐;DG250厭氧工作站 英國Don Whitley公司;6盤蒸飯機 樂創(chuàng)自動化技術(shù)股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳酸菌的分離 將采集到的米酒樣品裝入樣品瓶中放入樣品箱迅速帶回實驗室。乳酸菌的分離采用倍比稀釋法,取適當(dāng)梯度稀釋液涂布于MRS固體培養(yǎng)基,于DG250厭氧工作站30 ℃培養(yǎng)48 h,然后按照菌落形態(tài)的特點,挑取單菌落并純化3次,然后進行革蘭氏染色與過氧化氫酶實驗[6],初步確認(rèn)為乳酸菌后,使用30%甘油保存于-80 ℃冰箱。

1.2.2 乳酸菌的鑒定 乳酸菌的鑒定主要通過分析16S rDNA基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進行確定:首先收集乳酸菌菌體,然后按照細(xì)菌DNA提取的標(biāo)準(zhǔn)方法[7]獲得乳酸菌總DNA,并以之為模板進行PCR擴增。PCR引物使用27F與1495R[8],PCR擴增參照Mveobiang等[7]程序進行。獲得PCR產(chǎn)物后,進行連接與轉(zhuǎn)化,隨后挑取陽性克隆子,送南京金絲瑞生物科技公司進行測序。在NCBI進行Blast,選取序列相似度≥99%的序列進行系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析。

1.2.3 黃酒制作 黃酒的制作工藝流程為:原料→浸米→蒸煮→發(fā)酵→后熟→澄清→煎酒(除菌)→成品。先稱取糯米經(jīng)室溫(25 ℃左右)浸泡約2 d,使用蒸飯機蒸熟約40 min至米無生心且不爛,攤晾至室溫后裝入發(fā)酵罐中。設(shè)置對照組:只加入麥曲(78.5 g麥曲/500 g糯米)與酒母(0.5 g酒母/500 g糯米)作為發(fā)酵劑,不接入乳酸菌干預(yù);設(shè)置乳酸菌干預(yù)組:發(fā)酵劑為麥曲(78.5 g麥曲/500 g糯米)與酒母(0.5 g酒母/500 g糯米)及各乳酸菌分離株(乳酸菌終濃度為105cfu/g糯米)。各組黃酒加入發(fā)酵劑后,再加入泡米漿水295 mL、煮沸后的冷水390 mL,攪拌均勻并按照接入乳酸菌菌株名稱編號,然后置于28 ℃發(fā)酵7 d,再18 ℃發(fā)酵14 d。黃酒發(fā)酵完成后,取400 mL以3000 r/min樣品離心10 min后取上清液,煮沸冷卻至室溫后裝入樣品瓶中備用。

1.2.4 黃酒品質(zhì)評價

1.2.4.1 黃酒樣品中有機酸的測定 使用高效液相色譜對黃酒樣品的有機酸進行測定。樣品處理:取2 mL黃酒樣品使用超純水定容到10 mL,然后取5 mL溶液過0.45 μm濾頭,隨后裝于樣品瓶中待測。先配制草酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸、蘋果酸、乳酸、乙酸和乳酸這些食品中常見有機酸制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,然后按照以下色譜條件進行有機酸的測定[9]:ZORBAX SB-AQ(4.6×250 mm,5 μm);流動相:0.01 mol/L的磷酸二氫鉀溶液(使用正磷酸調(diào)節(jié)pH至2.9),柱溫為30 ℃,流速為1 mL/min,進樣體積為20 μL。

1.2.4.2 黃酒樣品的滋味分析 取黃酒樣品在3000 r/min離心10 min后的上清液,參照王玉榮等[10]的方法,使用電子舌測定各黃酒樣品的酸、苦、澀、鮮和咸,5個基本味,以及3個基本味苦味、澀味、鮮味的回味。先將電極活化,測得酸、苦、澀、鮮和咸味這些基本味值,然后再測得3個回味的強度值。將未接乳酸菌的對照處理黃酒樣品的滋味定義為0,測得的均為滋味的相對強度。

1.2.4.3 可溶性固形物的測定 參照國標(biāo)GB/T 12143-2008使用阿貝折光儀進行[11],測定條件為20 ℃,直接在儀器上讀出可溶性固形物數(shù)值并記錄。

1.3 統(tǒng)計分析

本文中圖均使用Origin 8.5繪制,顯著性分析使用SPSS 18.0中的LSD法計算,對黃酒滋味進行主成分分析法(Principal component analysis,PCA)使用past軟件進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酒樣品中乳酸菌的分離

通過傳統(tǒng)培養(yǎng)方法,以MRS培養(yǎng)基從傳統(tǒng)發(fā)酵方式獲得的襄陽米酒中共分離到9株形態(tài)各異的細(xì)菌,它們過氧化氫酶為陰性,且在含有1.5%碳酸鈣的MRS固體培養(yǎng)基上均有透明圈出現(xiàn)(見表1),初步判斷分離菌株是乳酸菌[12]。

表1 乳酸菌分離株形態(tài)觀察Table 1 Results of morphological observation of the isolated LAB

2.2 乳酸菌分離株的鑒定

通過PCR獲得的乳酸菌分離株的16S rDNA基因,對比DNA Marker,獲得的PCR片段大小為1500 bp左右(見圖1),與文獻報道的16S rDNA基因大小相當(dāng)[13]。然后將PCR產(chǎn)物進行純化并與pMD18-T克隆載體連接后,進行轉(zhuǎn)化后挑陽性克隆子進行測序。隨后將獲得的乳酸菌菌株16S rDNA基因序列進行了比對。同時選取相似度較高的已公布的乳酸菌模式種的16S rDNA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,以進行系統(tǒng)發(fā)育分析。

圖1 乳酸菌分離菌株16S rDNA基因擴增片段電泳圖Fig.1 Agrose gel electrophoresis of 16S rDNA from isolated LAB strains by PCR注：M:DL2000 marker;1～9:乳酸菌分離株的16S rDNA基因的PCR產(chǎn)物。

由圖2可知,根據(jù)16S rDNA基因的系統(tǒng)發(fā)育分析,可將從米酒中分離得到的9株菌分為2個菌屬,分別是片球菌屬與魏斯氏菌屬。MJ5-1與MJ6-1,屬于片球菌屬,進一步分析表明,它們均屬于戊糖片球菌。

圖2 所分離乳酸菌16S rDNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of isolated LAB based on the 16S rDNA gene

另外7株乳酸菌經(jīng)過分析,將它們都?xì)w為魏斯氏菌屬,可以細(xì)分為2個菌種,分別是融合魏斯氏菌與食竇魏斯氏菌。由圖2可知,MJ2-1、MJ3-1、MJ4-1屬于融合魏斯氏菌,而MJ7-1、MJ8-1、MJ9-1、MJ10-1屬于食竇魏斯氏菌。根據(jù)對黃酒中乳酸菌的報道,黃酒或者黃酒所用發(fā)酵劑中常見的乳酸菌類型[3-4]為腸球菌屬(Enterococcus),魏斯氏菌屬,明串珠菌屬(Leuconostoc),乳桿菌屬(Lactobacillus)和片球菌屬,分離到的乳酸菌種屬與米酒研究的相關(guān)報道相一致[14-15],表明與米酒一樣,黃酒中的乳酸菌資源極為豐富,是乳酸菌的寶貴資源庫。另有研究認(rèn)為,紅曲黃酒的紅曲中,則以伯克氏菌屬(Burkholderia)與芽孢桿菌屬(Bacillus)為主,另外也存在著上述的一些乳酸菌屬[16]。然而,本研究未從孝感地區(qū)米酒中分離得到腸球菌屬、明串珠菌屬、乳桿菌屬乳酸菌。

2.3 乳酸菌對黃酒有機酸的影響

在黃酒發(fā)酵過程中,淀粉質(zhì)等原料組分被糖化發(fā)酵劑轉(zhuǎn)化為還原性糖類,然后被黃酒中的各類微生物代謝轉(zhuǎn)化成乙醇、有機酸、酯類等揮發(fā)性物質(zhì)這些復(fù)雜多樣的代謝物,從而呈現(xiàn)出黃酒誘人風(fēng)味品質(zhì)與豐富的營養(yǎng)[2-3]。所以黃酒發(fā)酵工藝及發(fā)酵劑的選擇勢必會影響到黃酒的有機酸組成,對黃酒的滋味產(chǎn)生影響。

黃酒中主要有機酸類型包括檸檬酸、草酸、酒石酸、乳酸、蘋果酸、乙酸、琥珀酸等,一般通過液相色譜法進行測定[17-18]。由圖3可知,釀制的黃酒中有機酸有乳酸、乙酸、草酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸、蘋果酸,且樣品中的乳酸、琥珀酸和蘋果酸含量較高。與未接菌處理相比,乳酸菌干預(yù)處理黃酒樣品中琥珀酸、乙酸與檸檬酸未表現(xiàn)出顯著差異(p>0.05)。而接入乳酸菌MJ2-1處理黃酒樣品草酸增加到1.11 g/L,與未接菌處理相比增加了2.96倍。未接乳酸菌處理黃酒樣品乳酸與蘋果酸含量分別為6.35、6.09 g/L,接入乳酸菌MJ3-1、MJ4-1、MJ6-1與MJ8-1處理的黃酒樣品乳酸含量分別為8.48、19.68、8.78、8.81 g/L,蘋果酸含量分別為1.08、1.04、3.10、1.13 g/L,表明乳酸菌顯著改變了這些黃酒樣品的乳酸與蘋果酸組成(p<0.05)。

圖3 黃酒樣品有機酸含量Fig.3 Content of organic acid of Chinese rice wine samples

乳酸主要由乳酸菌代謝產(chǎn)生,由圖3可知,在添加乳酸菌的干預(yù)下,蘋果酸含量顯著減少(p<0.05),而乳酸含量顯著增加(p<0.05),尤其是在菌株MJ4-1減少蘋果酸增加乳酸的作用最強。蘋果酸酸度較乳酸高,有研究認(rèn)為,在一些乳酸菌作用下會發(fā)生蘋果酸-乳酸發(fā)酵,將蘋果酸轉(zhuǎn)化成乳酸以降低酒類酸度,該作用主要用來進行葡萄酒降酸。結(jié)果顯示,4株乳酸菌MJ3-1、MJ4-1、MJ6-1與MJ8-1乳酸菌可能引發(fā)了黃酒發(fā)酵過程中的蘋果酸-乳酸代謝,使黃酒樣品中蘋果酸顯著降低(p<0.05),而融合魏斯氏菌MJ4-1對黃酒的蘋果酸乳酸發(fā)酵作用最強,與未接菌處理黃酒樣品相比黃酒乳酸含量增加了2倍多,而蘋果酸含量減少了85%,表明菌株MJ4-1是一株可以用作黃酒調(diào)酸的優(yōu)良乳酸菌。

2.4 乳酸菌對黃酒滋味的影響

滋味品質(zhì)是影響消費者選擇的一個重要因素,研究表明黃酒滋味主要在黃酒發(fā)酵的第8～15 d形成[19]。目前對影響黃酒滋味的微生物因素的研究尚少,使用優(yōu)質(zhì)黃酒發(fā)酵劑釀制出來的黃酒滋味體驗出色,更容易受到消費者的青睞。由于在食品的品鑒中,主觀因素可能會引起誤差,因此本研究對乳酸菌干預(yù)下的黃酒滋味使用電子舌進行了測定,結(jié)果見圖4。由圖可知,乳酸菌干預(yù)處理的黃酒樣品酸味、咸味與豐(厚)度均發(fā)生了顯著變化(p<0.05),酸味呈下降趨勢,而咸味與豐度顯著增加。結(jié)合有機酸測定結(jié)果,黃酒在乳酸菌的作用下,乳酸含量增加,而部分樣品蘋果酸含量減少,酸度有所降低,這與滋味測定結(jié)果相一致。

圖4 黃酒中各滋味相對強度Fig.4 Relative intensity of taste of Chinese rice wine samples注:標(biāo)識‘*’表示對照組與乳酸菌處理組間差異顯著(p<0.05)。

2.5 黃酒樣品滋味品質(zhì)的主成分分析

對乳酸菌滋味進行了的PCA分析以深入追溯乳酸菌對黃酒滋味品質(zhì)的影響,結(jié)果如圖5和圖6所示。由圖5可知,第一主成分與第二組成分貢獻率為97.70%:第一組成分中,黃酒樣品滋味因素由酸味、鮮味和豐度構(gòu)成,其貢獻率為89.76%;第二主成分由苦味、澀味、咸味、后味A(澀的回味)和后味B(苦的回味)3個滋味基本指標(biāo)和兩個回味指標(biāo)構(gòu)成,貢獻率為7.94%。結(jié)果表明,乳酸菌對黃酒滋味的影響,主要由酸味、鮮味和豐度3個滋味基本指標(biāo)的變化引起,與黃酒有機酸與滋味品質(zhì)測定結(jié)果一致。

圖5 基于主成分分析的黃酒樣品滋味品質(zhì)因子載荷圖Fig.5 Graphy of factor loading based on PCA of the taste profile characterization of the yellow wine

對黃酒樣品滋味進行了PCA分析,圖6展示了添加乳酸菌對黃酒滋味品質(zhì)的PCA各因子得分,未添加乳酸菌發(fā)酵的黃酒樣品位于第三象限,而添加乳酸菌處理黃酒樣品聚集在第一、二、四象限,表現(xiàn)出了顯著性差異(p<0.05)。另外,黃酒樣品在滋味品質(zhì)上呈現(xiàn)出了基于添加乳酸菌種屬的特征性分布,添加了融合魏斯氏菌MJ2-1、MJ3-1、MJ4-1的黃酒樣品聚集在一起,而添加了食竇魏斯氏菌MJ7-1、MJ8-1、MJ9-1、MJ10-1的黃酒樣品聚集在一起,但是戊糖片球菌MJ5-1與MJ6-1未分布在一起,表明魏斯氏菌屬各個種水平的乳酸菌對黃酒滋味品質(zhì)的作用類似。

圖6 基于主成分分析的黃酒樣品滋味品質(zhì)因子得分圖Fig.6 Graphy representation the component score by PCA of the taste profile characterization of the yellow wine

2.6 乳酸菌對黃酒固形物的影響

可溶性固形物是黃酒的一項重要指標(biāo),黃酒中的可溶性固形物主要指糖類物質(zhì)組成。由圖7可知,對照組的可溶性固形物含量為8.39 g/100 g,而添加乳酸菌處理黃酒樣品的可溶性固形物含量均在11.28 g/100 g以上,較未接菌處理顯著增加(p<0.05),其中乳酸菌MJ2-1、MJ5-1與MJ10-1干預(yù)下的黃酒樣品固形物增加得最多,是未接菌處理樣品的1.56倍左右。在魏斯氏菌MJ4-1作用下,黃酒固形物增加了34%,為乳酸菌處理組最低。

圖7 黃酒樣品可溶性固形物含量Fig.7 Content of soluble solid of yellow wine samples注:不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。

3 結(jié)論

孝感米酒中蘊含著豐富的乳酸菌資源,從孝感米酒中分離得到9株乳酸菌并進行了鑒定,結(jié)果顯示分離到的乳酸菌屬于片球菌和魏斯氏菌兩個菌屬,屬于戊糖片球菌、融合魏斯氏菌與食竇魏斯氏菌3個菌種。將分離并鑒定了的乳酸菌添加到黃酒醪液中進行共發(fā)酵,結(jié)果顯示它們對黃酒的有機酸含量、固形物及滋味品質(zhì)均有影響。在融合魏斯氏菌MJ3-1、MJ4-1、戊糖片球菌MJ6-1與食竇魏斯氏菌MJ8-1干預(yù)下,黃酒乳酸含量顯著增加(p<0.05),蘋果酸顯著減少(p<0.05),其中尤其是融合魏斯氏菌MJ4-1的乳酸-蘋果酸轉(zhuǎn)化作用最強,可用于黃酒有機酸調(diào)酸,是開發(fā)黃酒復(fù)合型發(fā)酵劑的優(yōu)秀候選菌株。對黃酒滋味的分析表明,乳酸菌干預(yù)下,黃酒的酸味、咸味和豐度發(fā)生了顯著變化(p<0.05)?；赑CA分析,分離到的魏斯氏乳酸菌對黃酒滋味影響較為相近。