草魚肌原纖維蛋白-葡萄糖糖基化產(chǎn)物的理化特性及乳化特性研究

楊宇鴻,董士遠(yuǎn),靳衛(wèi)亞,毛振杰,蘇明月,岳 敏

(中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266003)

魚肉蛋白具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,其主要成分為肌原纖維蛋白,具有較強(qiáng)的凝膠性和保水性,但熱穩(wěn)定性和溶解性較差[1]。為了提高蛋白質(zhì)的某些功能性質(zhì),可以對(duì)魚肉蛋白進(jìn)行改性。改性的方法通常有物理法、化學(xué)法、酶法。物理改性的設(shè)備投入相對(duì)大且改性范圍相對(duì)窄;傳統(tǒng)的化學(xué)改性通常會(huì)引入一些化學(xué)試劑,其安全性受到質(zhì)疑;酶法的缺點(diǎn)是選擇合適的酶、控制反應(yīng)條件比較困難,而且酶的價(jià)格相對(duì)比較昂貴[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn),糖基化修飾在一定程度上可克服蛋白質(zhì)遇熱不穩(wěn)定問題,可極大地改善蛋白質(zhì)功能特性,如溶解性、熱穩(wěn)定性、乳化性及抗氧化性等,而且反應(yīng)過程中不需要化學(xué)催化,反應(yīng)條件簡(jiǎn)單,安全性大大提髙。因此,糖基化修飾被認(rèn)為是改善蛋白質(zhì)理化性質(zhì)和功能特性的有效手段之一。糖基化反應(yīng)分為干法和濕法兩種,濕法糖基化反應(yīng)由于水分含量高、蛋白質(zhì)溶解分散性差、所需的反應(yīng)溫度相對(duì)較高等原因,反應(yīng)較難控制;而干法糖基化雖工藝過程相對(duì)復(fù)雜,但反應(yīng)條件溫和,反應(yīng)過程比較容易控制,是目前對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行美拉德反應(yīng)改性普遍采用的方法[1,3-4]。

目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)于魚肉蛋白的糖基化改性研究主要集中在對(duì)鯉魚、鰱魚、羅非魚等肌原纖維蛋白的溶解性、熱穩(wěn)定性、乳化性、抗氧化性以及鈣結(jié)合能力等方面的研究,如Saeki[5]、Sato等[6]和Fujiwara等[7]分別利用核糖、褐藻寡糖和葡聚糖對(duì)鯉魚肌原纖維蛋白進(jìn)行糖基化改性,發(fā)現(xiàn)糖基化后的肌原纖維蛋白的溶解度、乳化性和熱穩(wěn)定性分別得到了顯著性地提高。陳欣等[8]以葡萄糖、殼聚糖和羧甲基纖維素鈉作為糖基供體對(duì)羅非魚肌原纖維蛋白進(jìn)行干法糖基化反應(yīng),發(fā)現(xiàn)糖基化可以提高羅非魚肌原纖維蛋白的溶解性和熱穩(wěn)定性。張愛榮等[9],尤娟等[10],You等[11],Liu等[12]分別以乳糖、低聚異麥芽糖、葡萄糖、魔芋甘露寡糖為糖基供體,與鰱魚肌原纖維蛋白糖基化反應(yīng),發(fā)現(xiàn)鰱魚肌原纖維蛋白溶解性、熱穩(wěn)定性、乳化性、抗氧化性、鈣結(jié)合能力顯著性提高。目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)草魚蛋白的糖基化反應(yīng)研究,主要集中在制備草魚蛋白酶解液調(diào)味料[13-15],提高草魚肽的抗氧化性[16]以及降低過敏性[17]等,而關(guān)于草魚肌原纖維蛋白糖基化反應(yīng)特性研究及功能改性研究鮮有報(bào)道。利用糖基化改性草魚肌原纖維蛋白的乳化性能[1]對(duì)提高其在食品中的應(yīng)用具有重要意義。

本研究以草魚肌原纖維蛋白為原料,系統(tǒng)地分析了不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)制備的草魚肌原纖維蛋白-葡萄糖糖基化產(chǎn)物理化特性(包括糠氨酸含量、熒光強(qiáng)度、游離氨基含量、色差值)以及蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)、乳化特性的影響。這將為糖基化在草魚肌原纖維蛋白改性中的實(shí)際應(yīng)用提供理論基礎(chǔ),也為草魚肌原纖維蛋白在食品工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮草魚(2～3 kg/尾) 青島市臺(tái)東水產(chǎn)批發(fā)市場(chǎng);溴化鉀(光譜純) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)品 Neosystem Laboratoire公司;鏈霉蛋白酶E(酶活7000 U/g) 北京索萊寶公司;其他試劑(分析純) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

GL-21M型高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)儀器公司;LC-20AT型高效液相色譜儀、UV-2250型紫外可見分光光度計(jì) 日本島津公司;F-4600型熒光分光光度計(jì) 日本島津公司;Nicolet IS10型傅里葉紅外光譜儀 賽默飛世爾科技有限公司;HP-200型精密色差儀 上海澳程檢測(cè)儀器有限公司;IKA T18 basic型高速分散均質(zhì)機(jī) 德國(guó)IKA儀器設(shè)備有限公司;超濾離心管(3 kDa) Amicon?Ultra-15。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 草魚肌原纖維蛋白的提取 草魚肌原纖維蛋白的提取采用Liu等[18]的方法。新鮮草魚去頭、去尾、去內(nèi)臟后,取其背脊肉凍藏于-20 ℃以待備用。取一定質(zhì)量的草魚肉,加入10倍體積預(yù)冷的50 mmol/L pH7.0的磷酸鹽緩沖溶液,勻漿,浸提30 min后離心(4 ℃,8000 r/min,10 min)取其沉淀,重復(fù)上述步驟2次。將得到的沉淀加入10倍體積50 mmmol/L pH7.0的磷酸鹽緩沖液(含0.6 mol/L的KCl),勻漿2 min,攪拌浸提12 h,浸提液于4 ℃、8000 r/min離心10 min,取上清液加入3倍體積(v/v)預(yù)冷的蒸餾水,攪拌30 min后離心(4 ℃,8000 r/min,10 min),然后將沉淀冷凍干燥(真空度:1.3～13 Pa,冷阱溫度:-10～-50 ℃)即得草魚肌原纖維蛋白。上述所有操作均在4 ℃以下進(jìn)行。

1.2.2 草魚肌原纖維蛋白-葡萄糖糖基化產(chǎn)物制備 參考Han等[19]的方法制備草魚肌原纖維蛋白-葡萄糖糖基化產(chǎn)物。草魚肌原纖維蛋白與葡萄糖按1∶2(w/v)的比例分散于0.1 mol/L pH7.0的磷酸緩沖溶液中,均質(zhì)混勻后,冷凍干燥得到干粉。稱取一定量的凍干粉進(jìn)行干熱糖基化反應(yīng),相對(duì)濕度保持在44%,溫度為50 ℃,分別于0、6、12、24、48、72、96、168 h時(shí)取樣,制備草魚肌原纖維蛋白-葡萄糖糖基化產(chǎn)物。將得到的反應(yīng)樣品配制成濃度為5 mg/mL水溶液。加入超濾離心管中,6000 r/min條件下,于4 ℃離心20 min進(jìn)行脫糖,重復(fù)3次上述步驟(苯酚硫酸法檢測(cè)上清液中無葡萄糖檢出)后,得到的沉淀分散于蒸餾水中冷凍干燥。

1.2.3 糠氨酸含量的測(cè)定 參照Amigobenavent等[20]的方法。稱取反應(yīng)樣品于安瓿瓶中,加入一定體積的9 N HCl,使其終濃度為6.25 mg/mL,充氮1 min,用酒精噴燈進(jìn)行高溫封口。隨后在110 ℃條件下,水解23 h。將水解液過0.22 μm的濾膜,取0.5 mL濾液冷凍干燥后,復(fù)溶于1 mL體積比為95∶5∶0.2的超純水∶乙腈∶三氟乙酸溶液中。取20 μL用于高效液相色譜測(cè)定。

高效液相色譜測(cè)定條件:色譜柱:C8(250×4.6 mm,5 μm,Alltech furosine專用);流動(dòng)相為A:0.4%乙酸的超純水;B:含有0.3% KCl的A,流速:1 mL/min;洗脫條件:98% A+2% B,等梯度洗脫;柱溫:30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng):280 nm。

1.2.4 游離氨基的測(cè)定 參照J(rèn)vande等[21]的方法。稱取一定量的反應(yīng)樣品分散于2.5%的SDS溶液中充分混勻,使其終濃度為5 mg/mL。將混合液在70 ℃的水溶液中水浴20 min,于20 ℃ 14000 r/min離心10 min,取上清液用OPA法測(cè)定游離氨基的含量。

1.2.5 褐變強(qiáng)度的測(cè)定 采用色差計(jì)對(duì)不同反應(yīng)時(shí)間的反應(yīng)樣品褐變強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)測(cè)定了L*值、a*值和b*值。根據(jù)以下公式計(jì)算ΔE,將其作為褐變強(qiáng)度。

其中“s”為樣品的值,“0”為反應(yīng)時(shí)間0 h樣品的值。

1.2.6 熒光強(qiáng)度的測(cè)定 參照Morale等[22]的方法。稱取30 mg反應(yīng)樣品,加入3 mL 0.375 mg/mL 鏈霉蛋白酶E(溶于0.1 mol/L pH7.4四硼酸鈉溶液中),40 ℃水浴條件下振蕩36 h。冷卻之后,于4 ℃,4500×g離心10 min,將上清液過0.45 μm濾膜。用于熒光測(cè)定。熒光光譜分析參數(shù):激發(fā)波長(zhǎng)347 nm,發(fā)射波長(zhǎng)415 nm。狹縫寬度Ex/Em=5 nm/nm,響應(yīng)時(shí)間0.5 s,掃描方式為時(shí)間掃描20 s。熒光值用AU表示。

1.2.7 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)紅外分析

1.2.7.1 傅里葉變換紅外光譜分析(FTIR) 取一定量的不同反應(yīng)時(shí)間的反應(yīng)樣品與溴化鉀共同研磨壓片,用溴化鉀做背景,進(jìn)行全波段(4000～400 cm-1)掃描,每次信號(hào)累加掃描64次,分辨率為4 cm-1。

1.2.7.2 譜圖分析 紅外圖譜分析采用OMNIC 8.0數(shù)據(jù)處理軟件,采用Peakfit 4.12軟件對(duì)酰胺Ⅰ帶(1600～1700 cm-1)進(jìn)行去卷積和曲線擬合,多次擬合使R2大于0.97。根據(jù)李向紅等[23]的研究,確定各子峰和二級(jí)結(jié)構(gòu)各成分的關(guān)系,計(jì)算積分面積,分析糖基化反應(yīng)后對(duì)草魚肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。

1.2.8 乳化性的測(cè)定 參考Pearce等[24]的方法略作改動(dòng)。將反應(yīng)樣品溶于50 mmol/L PBS(pH7.4),使其終濃度為3 mg/mL。將配制的樣品溶液和純花生油以3∶1的比例在離心管中混合,并以13500 r/min在冰水中均質(zhì)1 min。然后立即從管底取出0.1 mL,并用0.1% SDS稀釋至5 mL,在500 nm處測(cè)其吸光值。常溫下靜置10 min后,從管底吸取0.1 mL,用0.1% SDS稀釋至5 mL,在500 nm處測(cè)其吸光值。乳化性(EAI)和乳化穩(wěn)定性(ESI)根據(jù)以下公式計(jì)算。

其中,A0和A10分別為0 min和10 min時(shí)500 nm處測(cè)定的吸光值,D為稀釋系數(shù),C為蛋白濃度,φ為油相所占體積分?jǐn)?shù),L為光路徑寬度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 19.0,組間差異顯著性分析采用方差分析(Analysis of Variance,ANOVA),p<0.05為有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 糠氨酸含量的變化

糠氨酸是由糖基化反應(yīng)初級(jí)階段的特征產(chǎn)物Amadori產(chǎn)物水解產(chǎn)生,其含量可以用來檢測(cè)糖基化反應(yīng)程度。樣品中糠氨酸含量隨反應(yīng)時(shí)間的變化如圖1所示。在反應(yīng)前12 h,樣品中糠氨酸含量隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)迅速增加,在48 h達(dá)到最高((4.09±0.07) mg/100 mg樣品);隨后呈現(xiàn)出降低的趨勢(shì),到反應(yīng)結(jié)束時(shí),其糠氨酸含量下降到(3.63±0.32) mg/100 mg樣品。因此,糖基化反應(yīng)過程中,糠氨酸含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì),這可能是由于隨著糖基化反應(yīng)的進(jìn)行,形成的初級(jí)階段產(chǎn)物進(jìn)一步向中間產(chǎn)物和末期產(chǎn)物轉(zhuǎn)化,導(dǎo)致糠氨酸含量的降低[25]。Yamaguchi等[25]也發(fā)現(xiàn)在L-賴氨酸與D-葡萄糖體系中,糠氨酸的含量隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢(shì)。

圖1 加熱時(shí)間對(duì)草魚肌原纖維蛋白-葡萄糖糖基化產(chǎn)物中糠氨酸含量的影響Fig.1 Effect of the heating time on Furosine content in grass carp myofibrillar protein glycated with glucose注:圖中不同小寫字母之間存在顯著性差異(p<0.05);圖2～圖3,圖6～圖7同。

2.2 游離氨基含量的變化

樣品中游離氨基含量隨反應(yīng)時(shí)間的變化如圖2所示。在反應(yīng)最初48 h,肌原纖維蛋白的游離氨基含量隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)呈逐漸下降趨勢(shì);反應(yīng)24 h時(shí),游離氨基含量較反應(yīng)前下降70.4%(p<0.05);隨后其含量趨于穩(wěn)定;反應(yīng)結(jié)束時(shí),游離氨基含量較反應(yīng)之前下降79.1%。糖基化反應(yīng)過程中蛋白或氨基酸中的游離氨基,尤其是賴氨酸和精氨酸中的ε-氨基和α-氨基,與羰基化合物共價(jià)結(jié)合,體系中游離氨基被消耗,呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)[27],隨后游離氨基趨于穩(wěn)定,這可能是因?yàn)殡S著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),初期產(chǎn)物發(fā)生一定程度的降解[28-29],且加熱造成一些蛋白質(zhì)中游離氨基的暴露[30],與糖基化反應(yīng)造成的游離氨基的損耗相抵消。此前Pirestani等[26]研究也發(fā)現(xiàn),在90 ℃水溶液反應(yīng)條件下,油籽分離蛋白和阿拉伯膠在反應(yīng)15 min內(nèi),游離氨基含量持續(xù)下降,15 min后游離氨基含量趨于穩(wěn)定。

圖2 加熱時(shí)間對(duì)草魚肌原纖維蛋白-葡萄糖糖基化產(chǎn)物中游離氨基含量的影響Fig.2 Effect of the heating time on Free amino groups content in grass carp myofibrillar protein glycated with glucose

2.3 褐變強(qiáng)度變化

褐變強(qiáng)度是評(píng)價(jià)糖基化反應(yīng)最終階段的指標(biāo)之一。樣品L*、a*、b*、褐變強(qiáng)度(ΔE)隨反應(yīng)時(shí)間的變化如表1所示。a*正值越大表示樣品顏色越偏紅,負(fù)值越小表示樣品顏色越偏綠;b*正值越大表示樣品顏色越偏黃,負(fù)值越小表示樣品顏色越偏藍(lán)。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),不同反應(yīng)時(shí)間制備的糖基化產(chǎn)物的L*值逐漸減少,這表示亮度隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低。除0 h樣品外,a*值均為正值且依次增大,表示隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),糖基化產(chǎn)物顏色都偏紅;b*值都為正,表示顏色都偏黃,且各組之間有顯著性差異(p<0.05),反應(yīng)96 h后,b*值變?yōu)樵瓉淼?3.8倍。這表明隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),糖基化產(chǎn)物的ΔE值逐漸增大,反應(yīng)結(jié)束時(shí)ΔE值為反應(yīng)開始前的37.8倍(p<0.05)。程恒等[34]研究也發(fā)現(xiàn):酪蛋白、β-酪蛋白和乳清蛋白與乳糖糖基化反應(yīng)過程中,隨著加熱時(shí)間的增加,三種乳蛋白-乳糖糖基化產(chǎn)物L(fēng)*值逐漸減小,a*值和b*值逐漸增大,這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。這說明加熱使體系發(fā)生了糖基化反應(yīng)并生成了有色物質(zhì),并且隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),產(chǎn)物顏色逐漸加深。

表1 加熱時(shí)間對(duì)草魚肌原纖維蛋白-葡萄糖糖基化產(chǎn)物L(fēng)*、a*、b*、ΔE值(褐變強(qiáng)度)的影響Table 1 Effects of the heating time on values of L*、a*、b*、ΔE in grass carp myofibrillar protein glycated with glucose

2.4 熒光強(qiáng)度的變化

糖基化反應(yīng)高級(jí)階段產(chǎn)物通常具有熒光特性,通過對(duì)樣品中熒光性的檢測(cè)可以初步判斷糖基化高級(jí)反應(yīng)的程度[31]。樣品的熒光強(qiáng)度隨反應(yīng)時(shí)間的變化如圖3所示。糖基化產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)先增加后降低的趨勢(shì),且反應(yīng)最初12 h其熒光強(qiáng)度的增加幅度較小;12 h之后,其熒光強(qiáng)度迅速增加,反應(yīng)至96 h達(dá)到最大值,熒光強(qiáng)度為反應(yīng)初期的4倍;反應(yīng)168 h后,熒光強(qiáng)度大幅減少,這可能是因?yàn)榫哂袩晒獾奈镔|(zhì)發(fā)生一系列反應(yīng)轉(zhuǎn)化成了無熒光性的色素物質(zhì)[32]。Pirestani等[26]在油菜分離蛋白和阿拉伯膠糖基化反應(yīng)的研究中也發(fā)現(xiàn),熒光強(qiáng)度隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增大,在15 min達(dá)到最大,而后持續(xù)降低直至反應(yīng)結(jié)束;Jiang等[33]也發(fā)現(xiàn)α-乳白蛋白和β-乳球蛋白與核糖在95 ℃濕法反應(yīng)條件下,熒光強(qiáng)度分別在1 h和2 h達(dá)到最大值,隨后迅速降低直至反應(yīng)結(jié)束。

圖3 加熱時(shí)間對(duì)草魚肌原纖維蛋白-葡萄糖糖基化產(chǎn)物熒光強(qiáng)度的影響Fig.3 Effect of the heating time on fluorescence intensity in grass carp myofibrillar protein glycated with glucose

2.5 紅外光譜分析

糖基化反應(yīng)過程中,葡萄糖分子與草魚肌原纖維蛋白共價(jià)結(jié)合。從FTIR譜圖(圖4)發(fā)現(xiàn),與未反應(yīng)肌原纖維蛋白相比,反應(yīng)之后的產(chǎn)物在1080 cm-1附近出現(xiàn)明顯的吸收峰,根據(jù)Geng等[35]的研究,此波段為C-O的伸縮振動(dòng),糖基化反應(yīng)過程中由于共價(jià)結(jié)合導(dǎo)致體系中羥基和碳氧鍵的增多,使得該波段吸收增強(qiáng)。此外,有文獻(xiàn)報(bào)道[36],3300 cm-1附近的峰是N-H伸縮振動(dòng)特征吸收峰。糖基化反應(yīng)之后,3300 cm-1附近吸收峰逐漸消失,主要是因?yàn)樘腔磻?yīng)過程中葡萄糖與肌原纖維蛋白的共價(jià)結(jié)合,導(dǎo)致N-H的減少,使得該波段吸收減少,也進(jìn)一步表明草魚肌原纖維蛋白與葡萄糖共價(jià)結(jié)合形成了共聚物。

圖4 加熱時(shí)間對(duì)草魚肌原纖維蛋白-葡萄糖糖基化產(chǎn)物FTIR的影響Fig.4 Effect of the heating time on the FTIR spectra in grass carp myofibrillar protein glycated with glucose

不同反應(yīng)時(shí)間的樣品的二級(jí)結(jié)構(gòu)如圖5所示。糖基化修飾對(duì)草魚肌原纖維蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)影響很小,α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角基本無變化,無規(guī)則卷曲整體呈增大趨勢(shì),但變化不明顯。反應(yīng)0 h時(shí),無規(guī)則卷曲百分含量為17.05%,而在反應(yīng)48 h達(dá)到最大18.21%,之后又降低至17.82%;β-折疊百分含量0 h樣品時(shí)為33.42%,反應(yīng)96 h后達(dá)到最低,下降至30.89%。此結(jié)論也與前人研究結(jié)果相一致:Sun等[37]研究雞卵清蛋白(OVA)與葡萄糖、乳糖和阿洛酮糖糖基化反應(yīng)過程中發(fā)現(xiàn),OVA經(jīng)糖基化反應(yīng)后,α-螺旋略微減少,β-折疊稍有增加,糖基化反應(yīng)對(duì)OVA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響較小;同樣地,Enomoto等[38]也發(fā)現(xiàn)干法反應(yīng)條件下,β-乳球蛋白與麥芽五糖糖基化反應(yīng)后并未對(duì)β-乳球蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)造成顯著性變化。

圖5 加熱時(shí)間對(duì)草魚肌原纖維蛋白-葡萄糖糖基化產(chǎn)物二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響Fig.5 Effects of the heating time on the secondary structure in grass carp myofibrillar protein glycated with glucose

2.6 乳化性和乳化穩(wěn)定性

乳化性是衡量蛋白質(zhì)促進(jìn)油-水型乳狀液形成能力的指標(biāo),乳化穩(wěn)定性是指維持乳狀液穩(wěn)定存在的能力。如圖6所示,反應(yīng)樣品的乳化性隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈先增加后降低的趨勢(shì)。反應(yīng)6 h時(shí),其乳化性未呈現(xiàn)顯著性變化(p>0.05);6 h之后迅速增加,在48 h達(dá)到最大(0.097 m2/g),為反應(yīng)初期的1.32倍;48 h之后乳化性逐漸降低,反應(yīng)168 h后,乳化性值為0.079 m2/g。如圖7所示,隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),反應(yīng)樣品的乳化穩(wěn)定性在6 h之前沒有顯著性增加,6 h之后迅速增加,在48 h也達(dá)到最大,從反應(yīng)初期的14.43 min增加到22.06 min(p<0.05),之后逐漸降低。閆冰等[39]研究葡聚糖與ε-聚賴氨酸共價(jià)復(fù)合物發(fā)現(xiàn),乳化穩(wěn)定性隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì),在反應(yīng)時(shí)間為18 h時(shí),乳化穩(wěn)定性達(dá)到最大值,這與本文的研究結(jié)果相一致。

圖6 加熱時(shí)間對(duì)草魚肌原纖維蛋白-葡萄糖糖基化產(chǎn)物乳化性的影響Fig.6 Effect of the heating time on the emulsifying activity in grass carp myofibrillar protein glycated with glucose

圖7 加熱時(shí)間對(duì)草魚肌原纖維蛋白-葡萄糖糖基化產(chǎn)物乳化穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of the heating time on the emulsifying stability in grass carp myofibrillar proteinglycated with glucose

草魚肌原纖維蛋白與葡萄糖糖基化反應(yīng)過程中,在反應(yīng)開始時(shí),少量糖的接入使得糖基化反應(yīng)產(chǎn)物具有兩親性,表面活性增大,從而使其乳化能力提高[40];然而,隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),蛋白質(zhì)發(fā)生變性以及溶解度的降低,導(dǎo)致其乳化能力的降低[12]。

研究發(fā)現(xiàn),在50 ℃,44% RH條件下,反應(yīng)48 h時(shí)(初級(jí)階段產(chǎn)物Amadori產(chǎn)物含量最高),肌原纖維蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性顯著提高,分別為反應(yīng)初期的1.32倍(p<0.05)和1.53倍(p<0.05);反應(yīng)48 h之后,乳化性和乳化穩(wěn)定性顯著降低(p<0.05)。由此,可以推斷糖基化早期階段可以改善魚肉肌原纖維蛋白的乳化性能,隨著糖基化反應(yīng)程度的加深會(huì)造成乳化性能的降低。因此,通過控制一定的反應(yīng)條件,可將反應(yīng)控制在初級(jí)階段,這對(duì)改善魚肉肌原纖維蛋白的功能特性非常重要。

2.7 相關(guān)性分析

糖基化反應(yīng)產(chǎn)物的乳化性能與其化學(xué)特性指標(biāo)的相關(guān)性如表2所示。乳化性與糠氨酸含量極顯著的正相關(guān)(r=0.74,p<0.01),與游離氨基含量呈極顯著的負(fù)相關(guān)(r=-0.54,p<0.01),但與色差ΔE和熒光強(qiáng)度無相關(guān)性;乳化穩(wěn)定性與糠氨酸含量、熒光強(qiáng)度呈極顯著的正相關(guān)(r=0.94,p<0.01;r=0.78,p<0.01),與色差ΔE呈顯著的正相關(guān)(r=0.51,p<0.05),與游離氨基含量呈極顯著的負(fù)相關(guān)(r=-0.93,p<0.01)。研究結(jié)果表明:草魚肌原纖維蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性受糖基化反應(yīng)程度的影響。這為提高魚肉肌原纖維蛋白乳化性能提供了參考。

表2 不同加熱時(shí)間制備的草魚肌原纖維蛋白-葡萄糖糖基化產(chǎn)物的化學(xué)特性指標(biāo)與乳化性能的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of the chemical characterization grass carp myofibrillar protein-glucose MRPs and the emulsifying property

3 結(jié)論

通過對(duì)草魚肌原纖維蛋白-葡萄糖糖基化產(chǎn)物糠氨酸、熒光強(qiáng)度、游離氨基含量以及色差的測(cè)定分析發(fā)現(xiàn),隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng),糠氨酸含量與熒光強(qiáng)度均呈先增大后減小的變化趨勢(shì),分別在反應(yīng)48 h((4.09±0.07) mg/100 mg樣品)和反應(yīng)96 h((4764.33±92.42) AU)達(dá)到最大值;游離氨基的含量逐漸降低,在48 h趨于穩(wěn)定;總色差ΔE值則逐漸增大。紅外光譜分析發(fā)現(xiàn),糖基化復(fù)合物二級(jí)結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生明顯的變化。與反應(yīng)初期相比,該復(fù)合物乳化性和乳化穩(wěn)定性也呈先增大后降低的趨勢(shì),均在48 h時(shí)達(dá)到最高值。進(jìn)一步通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),草魚肌原纖維蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性受糖基化反應(yīng)程度的影響。因此,通過對(duì)糖基化反應(yīng)的控制,實(shí)現(xiàn)了具有較高乳化性能的糖基化草魚肌原纖維蛋白的制備,這為草魚蛋白在食品工業(yè)化中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。