基于BSA模板熒光銅納米簇的生物傳感方法靈敏檢測四環(huán)素

王海波，董高麗，白宏宇，李 陽，毛安麗

(信陽師范學(xué)院 a.河南省豫南非金屬礦資源綜合利用重點實驗室；b.大別山農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用研究院，河南 信陽 464000)

0 引言

四環(huán)素(TC)作為一類重要的抗生素，已經(jīng)廣泛用于革蘭氏陽性菌和陰性菌引起的人類和動物感染的治療[1].然而由于四環(huán)素的過度使用，經(jīng)常會在日常食品中(如肉類、牛奶、蜂蜜等)發(fā)現(xiàn)四環(huán)素類抗生素殘留.因此，發(fā)展四環(huán)素檢測方法對于人類食品安全是非常重要的.目前，測定四環(huán)素的方法主要有高效液相色譜法、化學(xué)發(fā)光法、毛細管電泳法、衰減全反射傅立葉變換中紅外分析法、伏安分析法等[2-4].但是這些方法還存在一些不足，如需要昂貴的儀器設(shè)備、復(fù)雜的樣品準備程序以及費時的預(yù)處理過程.因此，開發(fā)簡單、快速的四環(huán)素檢測方法是迫切需要的.

熒光分析方法具有操作簡單、分析速度快、靈敏度高、選擇性好等優(yōu)點，已經(jīng)引起了研究人員的廣泛研究興趣[5].熒光金屬納米團簇作為一類新型的熒光納米材料，具有毒性低、光穩(wěn)定性強、生物相容性好、發(fā)射波長可調(diào)等優(yōu)點.近年來，熒光金屬納米團簇已經(jīng)成為研究熱點之一[6].與金納米簇、銀納米簇相比，銅納米簇的合成原料相對便宜[7].但是，由于制備高穩(wěn)定性的銅納米簇比較困難，關(guān)于銅納米簇研究的報道較少.此外，納米尺寸的銅簇表面容易氧化，導(dǎo)致其分散性較差.近來，Goswami等人發(fā)現(xiàn)牛血清白蛋白(BSA)可以作為模板用于合成熒光銅納米簇，所制備的銅納米簇抗氧化能力強，穩(wěn)定性好[8].因此，利用BSA模板的銅納米簇作為探針構(gòu)建熒光傳感方法能夠獲得較好的分析性能[9, 10].

本文制備了BSA模板的銅納米簇，并作為熒光探針，構(gòu)建一種非標記型熒光生物傳感新方法.利用四環(huán)素對BSA模板的銅納米簇的熒光猝滅作用，提出一種測定四環(huán)素的熒光傳感新方法.

1 實驗部分

1.1 試劑

牛血清白蛋白(BSA)、CuSO4·5H2O等試劑均購于生工生物工程(上海)股份有限公司；鹽酸四環(huán)素、青霉素、氨芐西林、鏈霉素、林可霉素、頭孢氨芐等抗生素購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司.緩沖體系為10 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH=8.0).實驗過程中所用水均為超純水，電阻率大于18.2 MΩ·cm.

1.2 儀器

F7000熒光光譜儀(Hitachi，日本)；Tecnai G2 F20 S-TWIN型場發(fā)射透射電子顯微鏡(TEM，F(xiàn)EI，美國).熒光信號測量采用氙燈作為光源，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm，激發(fā)波長為335 nm，發(fā)射光譜波長掃描范圍為385～600 nm.

1.3 BSA模板CuNCs的合成

CuNCs以BSA為模板，采用一步化學(xué)還原的方法進行合成.首先，在室溫攪拌的條件下，將1 mL 20 mmol/L的CuSO4溶液加入到5 mL 15 mg/mL的BSA溶液中.室溫下攪拌5 min，用1 mol/L的NaOH將上述混合溶液的pH值調(diào)節(jié)到12，溶液的顏色由藍色變?yōu)樽仙?將上述溶液在55 ℃攪拌條件下繼續(xù)反應(yīng)48 h，溶液顏色變?yōu)榱磷厣?所得溶液置于4 ℃冰箱保存.

1.4 四環(huán)素的檢測

1.5 牛奶樣品的準備

純牛奶樣品購自當?shù)爻?首先將純牛奶樣品用1%(體積分數(shù))的三氯乙酸超聲處理20 min，除去牛奶樣品中的蛋白質(zhì).然后，樣品用0.22m的濾膜進行過濾，除去樣品中的脂類.收集清液用于下一步實際樣品分析，采用標準加入法用于牛奶樣品中四環(huán)素含量的測定.

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗原理

非標記檢測四環(huán)素的熒光傳感方法原理如圖1所示.在該方法中，熒光CuNCs以BSA為模板，采用一步化學(xué)還原的方法進行合成.在335 nm最大激發(fā)波長激發(fā)條件下，BSA模板的CuNCs具有較強的熒光信號.當傳感體系中存在四環(huán)素時， CuNCs的熒光強度顯著降低.這可能是由于四環(huán)素與BSA模板CuNCs表面的基團發(fā)生相互作用，導(dǎo)致熒光信號的降低.利用熒光強度的顯著變化，本文設(shè)計了一種非標記型的熒光傳感方法用于四環(huán)素的靈敏測定.

圖1 非標記熒光傳感方法示意圖Fig. 1 Schematic illustration for the label-free fluorescent sensing strategy

2.2 BSA模板CuNCs的表征

BSA模板CuNCs的形貌通過透射電子顯微鏡(TEM)來進行表征.如圖2A所示，BSA模板CuNCs的近似于球形，平均粒徑在3 nm左右.BSA模板CuNCs的光學(xué)性能通過熒光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜來進行考察.圖2B為CuNCs的熒光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜.從圖中可以看出，CuNCs的最大激發(fā)波長為335 nm，最大發(fā)射波長為410 nm.此外，將BSA模板CuNCs置于4 ℃冰箱保存2個月，其熒光強度沒有發(fā)生明顯的變化，表明該CuNCs具有良好的穩(wěn)定性，可以作為熒光指示探針用于構(gòu)建熒光傳感新方法.

圖2 (A)BSA模板CuNCs的TEM圖；(B)BSA模板CuNCs的熒光激發(fā)光譜圖(a)和發(fā)射光譜圖(b)Fig. 2 (A) TEM image of BSA templated CuNCs; (B) Fluorescence excitation (a) and emission (b) spectra of BSA templated CuNCs

2.3 熒光傳感方法的可行性

為了評估該熒光傳感方法用于四環(huán)素的可行性，不同條件下BSA模板CuNCs的熒光強度進行了考察.圖3為不同條件下BSA模板CuNCs的熒光發(fā)射光譜圖.如圖3所示，BSA模板CuNCs在410 nm處有較強的熒光信號.當傳感體系中存在四環(huán)素時，CuNCs的熒光強度顯著減小，表明了該傳感方法的成功構(gòu)建.通過傳感體系熒光信號的變化，可以實現(xiàn)四環(huán)素的靈敏檢測.

圖3 不同條件下的BSA模板CuNCs的熒光發(fā)射光譜圖：(a)不存在四環(huán)素；(b)存在300 mol/L四環(huán)素Fig. 3 Fluorescence emission spectra of BSA templated CuNCs in the absence (a) and presence (b) of 300 mol/L tetracycline, respectively

2.4 實驗條件的優(yōu)化

為了獲得該傳感方法較好的分析性能，對緩沖溶液的pH值和四環(huán)素的孵育時間進行了優(yōu)化.

圖4 (A)緩沖溶液pH值的優(yōu)化;(B)四環(huán)素孵育時間的優(yōu)化Fig. 4 (A) The effect of pH value on the fluorescence intensity of BSA templated CuNCs in the absence and presence of 300 mol/L tetracycline, respectively. (B) The effect of incubation time oftetracycline on the fluorescence intensity of BSA templated CuNCs

如圖4A所示，緩沖溶液的pH值為8.0時，體系的熒光響應(yīng)最大，選擇pH 8.0作為最佳條件.圖4B為四環(huán)素孵育時間的優(yōu)化，從圖中可以看出，當四環(huán)素存在時，體系的熒光強度在1 min以內(nèi)迅速降低，1 min后熒光信號沒有明顯變化，表明四環(huán)素與CuNCs的反應(yīng)非?？焖?，1 min內(nèi)達到平衡.

2.5 傳感方法的分析性能

在優(yōu)化實驗條件下，對不同濃度四環(huán)素的熒光響應(yīng)進行了考察.圖5A為不同濃度四環(huán)素的熒光發(fā)射光譜圖.從圖中可以得出，隨著四環(huán)素濃度的不斷增加，熒光強度不斷降低.如圖5B所示，熒光信號(F0/F)與四環(huán)素濃度(CTC)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性檢測范圍為5.0×10-8～ 4.0×10-5mol/L，其線性方程為F0/F=1.1284 + 0.0180CTC(CTC為四環(huán)素濃度，mol/L)，相關(guān)性系數(shù)R=0.9911，檢出限為5.0×10-9mol/L.將本方法與文獻報道的方法進行了比較，列于表1.結(jié)果表明，本方法具有較寬的線性范圍和較高的靈敏度.

圖5 (A)不同濃度四環(huán)素的熒光發(fā)射光譜圖；(B)濃度校準曲線Fig. 5 (A) Fluorescence emission spectra of CuNCs in the presence of increasing tetracycline concentrations, the curves from top to bottom, the concentrations of tetracycline were 0, 0.05，0.1, 1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 300, 400, 500 and 600 mol/L, respectively. (B) The calibration curve between fluorescence response and tetracycline concentrations. Where, F0 and F were the fluorescence intensity of the sensing system in the absence and presence of tetracycline, respectively

表1 不同四環(huán)素檢測方法的分析性能比較Tab. 1 Performance comparison of the proposed method and other methods for TC detection

2.6 傳感方法的選擇性

在該傳感方法中，CuNCs與四環(huán)素發(fā)生相互作用，導(dǎo)致熒光強度降低.為了驗證該方法的選擇性，我們考察了其他抗生素、金屬離子、糖類、氨基酸對CuNCs的熒光信號的影響.結(jié)果表明，除了100mol/L的四環(huán)素類抗生素(鹽酸四環(huán)素、土霉素、金霉素)能夠產(chǎn)生顯著的熒光信號降低，1 mmol/L的其他干擾物質(zhì)(如Zn2+、Ca2+、葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、甘氨酸、組氨酸)均無明顯熒光信號降低，尤其是其他的抗生素(100mol/L的青霉素，氨芐西林，鏈霉素，林可霉素，頭孢氨芐)不產(chǎn)生熒光強度降低，表明該傳感方法具有良好的選擇性，可以用于實際樣品中四環(huán)素含量的測定.

2.7 實際樣品分析

將構(gòu)建的傳感方法用于牛奶樣品中四環(huán)素含量的測定，結(jié)果如表2所示.利用標準加入法進行測定，三次平行測定的相對標準偏差(RSD)為2.8%～3.3%，回收率為96.0%～102.8%之間，表明該方法準確性較好，可用于實際樣品的檢測.

表2 牛奶樣品中四環(huán)素含量的測定結(jié)果(n=3)Tab. 2 Detection results of tetracycline in milk samples

3 結(jié)論

以BSA模板的CuNCs作為熒光探針，利用四環(huán)素猝滅CuNCs的熒光信號，開發(fā)了一種快速、非標記的熒光傳感新方法用于四環(huán)素的靈敏檢測.該方法還可用于牛奶樣品中四環(huán)素的測定，在食品分析等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價值.