野菊花等復(fù)方中藥水煎液體外抗大腸桿菌活性研究

楊林松，王芳，紀(jì)蔚偉，沈玉環(huán)，丁淑敏2，朱孝霖2，壯子恒2

(1.常州大學(xué) 制藥與生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 常州213264；2.常州市藥品制造與質(zhì)量控制工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 常州213264)

0 引言

近年來，抗生素的普遍應(yīng)用促進(jìn)了耐藥性細(xì)菌的急劇增長，導(dǎo)致細(xì)菌感染的治療難度增大.而傳統(tǒng)中藥具有對(duì)細(xì)菌幾乎不產(chǎn)生耐藥性的優(yōu)點(diǎn)，在預(yù)防和治療細(xì)菌性感染疾病中發(fā)揮不可替代的作用.我國中藥資源豐富，其開發(fā)和應(yīng)用具有廣闊前景[1,2].野菊花、薄荷和藁本有疏風(fēng)散熱、解毒消腫等功效，是治療風(fēng)熱感冒的常用藥.野菊花(ChrysanthemumindicumL.)為菊科多年生草本植物，其頭狀花序部分，在我國民間藥用歷史悠久，可以防治感冒，中國藥典(2015版)收載其栓劑用于抗菌消炎[3].曾帥等人[4]使用野菊花水煎液體外抑菌，結(jié)表明果野菊花水煎液對(duì)試驗(yàn)用的12種菌株均有不同程度的抑菌作用.此外，白銀亮等人[5]研究了野菊花水提液對(duì)豚鼠離體回腸收縮的影響及其抑菌作用，結(jié)果也表明了野菊花具有一定的抑菌能力.薄荷(MenthahaplocalyxBritq.)成分中的揮發(fā)油[6，7]，具有抗炎鎮(zhèn)痛、抑菌、抗腫瘤、調(diào)節(jié)消化系統(tǒng)和平滑肌等生物活性.藁本(LigusticumsinenseOliv.)的干燥根莖部分，可以活血止血，用于治療心血管疾病以及婦科疾病[8].為了更好地利用中草藥的抗菌作用，常銀子[9]、趙萬鵬[10]等對(duì)以中草藥為原料的提取液及其組合的抑菌效果進(jìn)行了試驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)與單一原料提取液的抑菌作用相比，復(fù)合提取液對(duì)常見菌種均具有很強(qiáng)的抑制作用.本研究采用水煎法,對(duì)野菊花、薄荷和藁本為原料的提取液組合的抑菌效果進(jìn)行了試驗(yàn)研究.驗(yàn)證其對(duì)大腸桿菌的抗菌性，進(jìn)而為臨床上細(xì)菌性感染的治療提供參考.

1 材料

1.1 中藥

野菊花的干燥頭狀花序、薄荷的干燥地上部分和藁本的根莖及根等3種中藥購自江蘇常州萬仁大藥房有限公司.

1.2 菌種來源

大腸桿菌菌種(Escherichiacoli)來自常州大學(xué)制藥與生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室.

1.3 培養(yǎng)基

LB固體培養(yǎng)基：含有胰蛋白胨10 g、酵母浸出粉5 g、氯化鈉10 g、瓊脂18 g、水1 L，pH7.0.

胰蛋白胨，北京奧博星生物科技有限責(zé)任公司；牛肉浸膏、瓊脂、酵母浸膏，南京大治生物科技有限公司；氫氧化鈉、氯化鈉，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，均為分析純.

1.4 主要的儀器設(shè)備

生化培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械有限公司；壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；超凈工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 中藥的制備

取兩副復(fù)方中藥(野菊花30 g，薄荷5 g，藁本10 g)及大蔥白10 g放入砂鍋中，加1000 mL的蒸餾水，將中藥浸泡在水中1 h；100 ℃加熱30 min，過濾，收集濾液；濾渣中加入500 mL的蒸餾水，加熱100 ℃ 30 min，過濾，收集濾液；將兩次濾液混合加熱濃縮至100 mL.生藥濃度為1000 g/L；將藥液倒入50 mL塑料試管中貯存在4 ℃的冰箱中備用.

2.2 實(shí)驗(yàn)菌液的制備

菌種的斜面培養(yǎng)基均為LB培養(yǎng)基.將大腸桿菌接種到斜面培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h；培養(yǎng)活化：從斜面培養(yǎng)基挑取1環(huán)大腸桿菌接入50 mL LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)24 h，比濁管比濁，將菌液配成108CFU/mL，備用.

2.3 抑菌圈實(shí)驗(yàn)

采用藥敏紙片法測(cè)定大腸桿菌的抑菌圈大小.配制LB瓊脂培養(yǎng)基，121 ℃高壓滅菌20 min，分裝到培養(yǎng)皿中，每個(gè)平皿中15～20 mL培養(yǎng)基，制成平板；倍比稀釋的中藥液濃度依次為62.5、125、250、500、1000 g/L；涂布菌液(大腸桿菌菌懸液0.1 mL注入LB培養(yǎng)皿)，培養(yǎng)皿底部劃分為5個(gè)區(qū)域并標(biāo)號(hào)，每個(gè)培養(yǎng)皿作3個(gè)平行對(duì)照；直徑1 cm的濾紙片分別浸滿不同濃度的水煎液，按藥液稀釋度由高到低的順序依次放置在培養(yǎng)皿中的1～5號(hào)區(qū)域內(nèi)；37 ℃培養(yǎng)24 h后，測(cè)定抑菌圈直徑，直徑大小以mm為單位.

2.4 最低抑菌濃度和最低殺菌濃度檢測(cè)

2.4.1 最低抑菌濃度檢測(cè)

按試管2倍稀釋法檢測(cè)最低抑菌濃度(MIC).取7只高壓滅菌試管，各管分別加入1 mL液體LB培養(yǎng)基，在第一管中加入中藥水煎液1 mL(1000 g/L)，混勻后取1 mL加入2號(hào)試管中，2號(hào)試管混勻后取1 mL加入3號(hào)試管中，3號(hào)試管混勻后取1 mL加入4號(hào)試管中，依次稀釋至6號(hào)管，6號(hào)試管混勻后取1 mL棄去，7號(hào)管中不加水煎液作對(duì)照，稀釋后的濃度分別為：500、250、125、62.5、31.25、15.63 g/L、空白.各管分別加入用生理鹽水稀釋成含菌量為108CFU/mL的實(shí)驗(yàn)菌液0.1 mL，混勻，37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察大腸桿菌生長情況.判定無渾濁的試管的最低濃度即為MIC.

2.4.2 最低殺菌濃度的檢測(cè)

以判定為最低抑菌濃度的試管為界，從該標(biāo)號(hào)前的試管中分別取出0.1 mL均勻涂布于LB平板培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)皿放置在37 ℃培養(yǎng)18 h，計(jì)數(shù)菌落.以菌落數(shù)少于5個(gè)(3個(gè)復(fù)孔平均值)的藥物最高稀釋度為藥物對(duì)大腸桿菌的最低殺菌濃度(MBC).

2.5 大腸桿菌在不同濃度水煎液下的生長曲線

配制LB液體培養(yǎng)基分裝到5個(gè)錐形瓶中，1號(hào)瓶50 mL，2號(hào)瓶46.875 mL，3號(hào)瓶43.75 mL，4號(hào)瓶37.5 mL，5號(hào)瓶25 mL.121 ℃滅菌20 min；將藥液置于超凈工作臺(tái)中，紫外殺菌25 min；5個(gè)錐形瓶中分別加入水煎液0、3.125、6.25、12.5、25 mL，至其終濃度分別為空白、62.5、125、250、500 g/L；4個(gè)錐形瓶中分別接入大腸桿菌菌懸液，按1%的接種量接種，以加入菌液開始計(jì)時(shí)，此時(shí)計(jì)為0 h，用光電比濁計(jì)數(shù)法測(cè)此時(shí)的光密度值，然后將5瓶培養(yǎng)液放入空氣浴振蕩器內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件是37 ℃ 157 r/min，每2 h測(cè)一次培養(yǎng)液吸光度，用OD600表示大腸桿菌增殖的速率.

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05表示與對(duì)照組相比有顯著性差異，P<0.01表示有極顯著性差異.

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 抑菌圈

藥物對(duì)大腸桿菌抑菌圈實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示.1000、500、250和125 g/L濃度組可見濾紙片的周圍存在明顯的抑菌圈，在62.5 g/L濃度組區(qū)域?yàn)V紙片周圍抑菌圈不明顯.

圖1 大腸桿菌抑菌圈Fig. 1 The bacteriostatic ring of Escherichia coli

通過表1可知，該中藥水煎液在濃度≥125 g/L時(shí)，對(duì)大腸桿菌存在較明顯的抑菌圈，1000 g/L時(shí)最為明顯，與最低濃度組相比有顯著差異，且抑菌圈直徑大小呈現(xiàn)一定的藥液濃度依賴性，即藥液濃度越高，抑菌圈直徑越大.

表1 復(fù)方中藥水煎液對(duì)大腸桿菌抑菌圈直徑的影響Tab. 1 The influence of Chinese traditional compound medicine water decoction on the bacteriostatic circle diameter of Escherichia coli

注: *.P<0.05，與最低濃度組相比有顯著差異；

**.P<0.01，與最低濃度組相比有極顯著差異

3.2 最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)

3.2.1 中藥液處理大腸桿菌24 h后MIC的確定

由圖2可知，不同濃度的藥液處理大腸桿菌培養(yǎng)24 h后，250 g/L和500 g/L濃度組試管藥液濃度較深，未出現(xiàn)渾濁.而15.63、31.25、62.5、125 g/L濃度組試管底部開始出現(xiàn)菌落絮狀沉淀.對(duì)照管為未加藥液培養(yǎng)24 h后的空白菌液，顏色為黃白色，較渾濁.由此可初步判定，該藥液對(duì)大腸桿菌的MIC約為250 g/L.

圖2 不同濃度藥液處理大腸桿菌24 h后的MICFig. 2 MIC of Escherichia coli treated with different concentrations of water decoction

3.2.2 中藥液對(duì)大腸桿菌最低殺菌濃度(MBC)的判定

取500、250、125、31.25 g/L和對(duì)照管含菌藥液涂布平板，500、250 g/L號(hào)管內(nèi)含菌藥液不經(jīng)稀釋直接涂布平板，125、31.25 g/L號(hào)管含菌藥液稀釋100倍，對(duì)照管菌液稀釋1000倍，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后觀察菌落生長狀況.500 g/L平板，54個(gè)菌落；250 g/L平板，菌落約為200個(gè)；125、31.25和對(duì)照管平板，菌液濃度過高，均為菌苔.由此判定，該復(fù)方中藥對(duì)大腸桿菌的最低殺菌濃度MBC值為500 g/L.

3.3 大腸桿菌生長曲線

不同藥液濃度下繪制的大腸桿菌的生長曲線如圖3所示，藥液濃度≥250 g/L時(shí)，可以延長大腸桿菌生長的調(diào)整期，對(duì)大腸桿菌有明顯的抑菌效果.當(dāng)藥液濃度為62.5 g/L時(shí)，由于藥效組分濃度較低，藥液中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)如氨基酸，微量元素等是大腸桿菌生長所需，促進(jìn)了大腸桿菌的生長.藥液中抑菌成分的存在使大腸桿菌的對(duì)數(shù)期明顯縮短，藥液濃度越高，對(duì)數(shù)期越短.

圖3 不同濃度水煎液作用下大腸桿菌的生長曲線Fig. 3 The growth curve of Escherichia coli treated with different concentrations of water decoction

圖3的曲線雖然可以清晰地顯示各個(gè)藥物濃度處理培養(yǎng)液OD600值的變化趨勢(shì)，但是難以比較不同濃度復(fù)方中藥水煎液對(duì)大腸桿菌生長曲線的影響.設(shè)法剔除復(fù)方中藥水煎液自身對(duì)OD600值的影響，將各條曲線置于同一起點(diǎn)上，見圖4將有利于生長曲線的比較和分析.

從校正生長曲線圖4可以看出，不同濃度的生長曲線的不同階段均位于對(duì)照組之下，表明大腸桿菌的生長受到明顯的抑制.同時(shí)，生長曲線的對(duì)數(shù)期一般比對(duì)照平緩，說明大腸桿菌需要生長一段更長的時(shí)間才可以達(dá)到穩(wěn)定期，這一特征也可以看作是抑制作用的一個(gè)方面.

圖4 大腸桿菌的校正生長曲線Fig. 4 The corrected growth curve of Escherichia coli

4 結(jié)論

用水煎煮法獲取復(fù)方中藥野菊花、薄荷和藁本的水煎液，具有一定的體外抗菌效果.藥敏紙片法的結(jié)果顯示該復(fù)方中藥水煎液對(duì)大腸桿菌產(chǎn)生明顯抑菌圈，且其對(duì)大腸桿菌的MIC為250 g/L，MBC為500 g/L；大腸桿菌生長曲線實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明在藥液濃度>125 g/L時(shí)，中藥水煎液對(duì)大腸桿菌有明顯的抑菌效果，此實(shí)驗(yàn)結(jié)果與抑菌圈實(shí)驗(yàn)及大腸桿菌MIC實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致.諸多中藥具有抑菌或殺菌作用，其作用的菌種以及作用強(qiáng)弱各不相同[11-13]，其抑菌作用的機(jī)理可歸納為以下幾點(diǎn)：中藥有效成分的作用，與其他物質(zhì)協(xié)同作用，藥物的配伍影響等.中藥抑菌作用研究的手段和方法都在不斷地改進(jìn)，從單味中藥到復(fù)方中藥[14]，但目前對(duì)中藥抗菌作用的研究大多數(shù)都局限于體外，我們應(yīng)該將中藥抗菌作用的研究進(jìn)一步深入到體內(nèi)，從而推動(dòng)中草藥抗菌的研究和發(fā)展.

中藥成分復(fù)雜，藥效成分難以檢測(cè)，本研究雖闡明該復(fù)方中藥有抗菌作用，但對(duì)復(fù)方中藥抗菌作用的機(jī)理，藥物對(duì)細(xì)菌作用的靶點(diǎn)及細(xì)菌是否會(huì)有耐藥性等仍不明確，這些是今后研究的熱點(diǎn).

致謝：本工作受到江蘇省高校優(yōu)秀中青年教師和校長境外研修項(xiàng)目的支持.