食管鱗癌中CDK16的表達(dá)及其臨床病理意義

鄭 皓，景嘉楠，李鐵鵬，夏 鑫，軒 閣，董子明

(1.鄭州大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.河南省腫瘤醫(yī)院，河南 鄭州 450008；3.鄭州大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，河南 鄭州 450001；4.生物芯片上海國(guó)家工程研究中心，上海，201203)

0 引言

細(xì)胞周期分為G1、S、G2和M期，細(xì)胞周期由細(xì)胞周期素(Cyclins)、細(xì)胞周期素依賴性激酶(Cyclin Dependent Kinases, CDKs)、細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制蛋白(Cyclin Dependent Kinase Inhibitor, CDKI)共同調(diào)節(jié)[1-3].細(xì)胞呈現(xiàn)自主且無(wú)節(jié)制的增殖，即細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失控可以導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[4-6].食管癌(Esophageal Cancer, EC) 在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率在惡性腫瘤中位居第8位，死亡率居第6位[7,8].我國(guó)是世界上食管癌高發(fā)國(guó)家，每年食管癌新發(fā)病例超過(guò)22萬(wàn)例，死亡超過(guò)20萬(wàn)例[9].人類(lèi)CDK16基因定位于染色體Xp11.23.由CDK16基因編碼的細(xì)胞周期素依賴性激酶16 (Cyclin Dependent Kinase 16, CDK16)也被稱(chēng)為PCTAIRE1或PCTK1[10].CDK16是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可在終末分化細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，以及在胞吐分泌和分泌型蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程中發(fā)揮作用[11-13].

研究表明，細(xì)胞周期素依賴性激酶16(Cyclin Dependent Kinase 16, CDK16)在多種腫瘤中高表達(dá)，并在腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移以及凋亡的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[14-17].對(duì)食管鱗癌的診斷標(biāo)志物已經(jīng)有一些研究[18]，但是CDK16在食管癌中的表達(dá)情況目前尚不明晰.食管癌患者預(yù)后差，死亡率高[19].因此研究CDK16在食管癌中的表達(dá)及臨床病理意義，可為闡明CDK16參與食管癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，以及為食管癌的診斷和防治提供新的依據(jù).另外使用組織芯片技術(shù)可以同時(shí)研究某個(gè)蛋白在幾十個(gè)或上百個(gè)病例樣本中的表達(dá).由于實(shí)驗(yàn)條件一致，可以最大限度地降低實(shí)驗(yàn)誤差，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度[20,21].

本研究利用組織芯片研究CDK16在各類(lèi)型食管癌(鱗癌、基底細(xì)胞樣鱗癌、梭形細(xì)胞鱗癌、腺癌、腺鱗癌、未分化癌)以及15例原發(fā)型食管鱗癌(每1例包括癌/癌旁/淋巴結(jié)各1點(diǎn))組織樣本中的表達(dá)，以探討CDK16在食管癌中的表達(dá)及其臨床病理意義.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 芯片

本次研究中所使用的兩張組織芯片均由生物芯片上海國(guó)家工程研究中心(Biochip Shanghai National Engineering Research Center)提供.為了便于研究，分別將這兩張組織芯片命名為hESCC-TMA050和hESCC-TMA045.這兩張組織芯片上所有組織標(biāo)本點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的病患在手術(shù)前均未進(jìn)行過(guò)放療或化療，且均具有詳細(xì)的臨床病理資料.

編號(hào)為hESCC-TMA050的組織芯片上共有50個(gè)組織標(biāo)本點(diǎn)，有5例食管鱗狀細(xì)胞癌(癌/癌旁各1點(diǎn))、8例基底細(xì)胞樣鱗狀細(xì)胞癌(癌/癌旁各1點(diǎn))、4例梭形鱗狀細(xì)胞癌(2例癌/癌旁各1點(diǎn))、6例食管腺癌(4例癌/癌旁各1點(diǎn))、5例食管腺鱗癌(1例癌/癌旁各1點(diǎn))、1例食管未分化癌(癌/癌旁各1點(diǎn)).所有50個(gè)組織標(biāo)本點(diǎn)均勻的排布于載玻片上，沒(méi)有脫片，沒(méi)有明顯的位移或扭曲.組織芯片經(jīng)蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin Staining, HE)染色病理診斷證實(shí)，并附有HE染色結(jié)果.

編號(hào)為hESCC-TMA045的組織芯片上共有45個(gè)組織標(biāo)本點(diǎn)，共包括15例原發(fā)食管鱗狀細(xì)胞癌，每例包括癌/癌旁/淋巴結(jié)各1點(diǎn).45個(gè)組織標(biāo)本點(diǎn)均勻排布于載玻片上，沒(méi)有脫片，沒(méi)有明顯的位移或扭曲.組織芯片經(jīng)HE染色病理診斷證實(shí)，并附有HE染色結(jié)果.

1.1.2 試劑

SP-9000免疫組織化學(xué)試劑盒(包括封閉用山羊血清、生物素、標(biāo)記二抗和辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素)，北京中杉生物技術(shù)有限公司；DAB顯色液和EnVisionTM試劑盒，福州邁新生物技術(shù)公司，具體操作步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)；兔抗人CDK16多克隆抗體，英國(guó)Abcam公司.

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry, IHC)

首先，進(jìn)行切片的脫蠟水化，接著用濃度為3%的H2O2封閉切片10 min，然后，將切片放置于pH6.0～6.2的0.1%枸櫞酸緩沖液中微波修復(fù)20 min.隨后使用山羊血清封閉切片15 min，最后將切片放置于4 ℃冰箱中一抗過(guò)夜.

第二天，從冰箱中取出切片，待切片恢復(fù)室溫后，依次加入生物素化的二抗和辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，放置于37 ℃的烘箱中孵育30 min.然后依次進(jìn)行DAB顯色、蘇木素復(fù)染、梯度酒精脫水、二甲苯透明，最后使用中性樹(shù)膠封片.

1.2.2 結(jié)果判定

由經(jīng)驗(yàn)豐富的病理學(xué)專(zhuān)家獨(dú)立閱片，然后討論分析，最終確定免疫組織化學(xué)結(jié)果.CDK16陽(yáng)性染色以細(xì)胞漿或細(xì)胞核出現(xiàn)黃色或棕褐色為準(zhǔn).隨機(jī)選取10個(gè)視野(400×)，每個(gè)視野中約含100個(gè)腫瘤細(xì)胞.采用半定量計(jì)分方法判定染色結(jié)果，根據(jù)免疫組化的染色強(qiáng)度和染色細(xì)胞所占比例這二者的乘積來(lái)判定.

2 結(jié)果

2.1 組織芯片HE染色及IHC染色的有效性

編號(hào)為hESCC-TMA050的組織芯片上共有50個(gè)組織標(biāo)本點(diǎn)，經(jīng)HE染色后，殘缺點(diǎn)數(shù)為0，有效信息量為100%；經(jīng)IHC染色后，殘缺點(diǎn)數(shù)為0，有效信息量為100%，見(jiàn)圖1.

編號(hào)為hESCC-TMA045的組織芯片上共有45個(gè)組織標(biāo)本點(diǎn)，經(jīng)HE染色后，殘缺點(diǎn)數(shù)為1，有效信息量為97.8%；經(jīng)IHC染色后，殘缺點(diǎn)數(shù)為1，有效信息量為97.8%，見(jiàn)圖1.

圖1 兩張組織芯片的IHC染色結(jié)果及HE染色結(jié)果Fig. 1 IHC staining results and HE staining results of two tissue microarrays

2.2 CDK16在不同類(lèi)型食管癌中的表達(dá)

IHC染色結(jié)果可見(jiàn)，在食管鱗癌中，CDK16為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；在食管腺癌中，CDK16弱陽(yáng)性表達(dá)；在食管腺鱗癌中，CDK16中陽(yáng)性表達(dá)；在食管未分化癌中，CDK16強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，見(jiàn)圖2和圖3.

2.3 CDK16在食管鱗癌及其組織亞型中的表達(dá)

食管鱗癌的組織亞型主要包括基底樣食管鱗狀細(xì)胞癌和梭形食管鱗狀細(xì)胞癌這兩種.在本次研究中，CDK16在食管鱗狀細(xì)胞癌中呈現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；同時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CDK16在食管鱗癌的兩個(gè)組織亞型基底樣食管鱗狀細(xì)胞癌和梭形食管鱗狀細(xì)胞癌中也呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，見(jiàn)圖2.

圖2 CDK16在食管鱗癌及其組織亞型中的表達(dá)(原始放大倍數(shù)×200)Fig. 2 Expression of CDK16 in esophageal squamous cell carcinoma and its histological subtypes (Original magnification×200)

圖3 CDK16在其他類(lèi)型食管癌中的表達(dá)(原始放大倍數(shù)×200)Fig. 3 Expression of CDK16 in other types of esophageal cancer (Original magnification×200)

2.4 CDK16在不同分化程度食管鱗癌中的表達(dá)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在食管鱗癌的高分化癌組織中，CDK16呈現(xiàn)弱陽(yáng)性表達(dá)；在食管鱗癌的中分化癌組織中，CDK16為中陽(yáng)性表達(dá)；而在食管鱗癌的低分化癌組織中，CDK16呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，見(jiàn)圖4.

圖4 CDK16在不同分化程度食管鱗癌中的表達(dá)(原始放大倍數(shù)×200)Fig. 4 Expression of CDK16 in esophageal squamous cell carcinoma with different degrees of differentiation (Original magnification×200)

2.5 CDK16在不同臨床分期淋巴結(jié)中的表達(dá)

在陰性淋巴結(jié)(N0期)中，CDK16呈現(xiàn)為陰性染色，見(jiàn)圖5A；在陽(yáng)性淋巴結(jié)N1期中，CDK16陽(yáng)性染色呈弱陽(yáng)性，見(jiàn)圖5B；在陽(yáng)性淋巴結(jié)N2期中，CDK16陽(yáng)性染色為中陽(yáng)性，見(jiàn)圖5C；在陽(yáng)性淋巴結(jié)N3期中，CDK16陽(yáng)性染色為強(qiáng)陽(yáng)性，見(jiàn)圖5D.

圖5 CDK16在不同臨床分期淋巴結(jié)中的表達(dá)(原始放大倍數(shù)×200)Fig. 5 Expression of CDK16 in lymph nodes of different clinical stages (Original magnification×200)

注：A.陰性淋巴結(jié)(N0期),B.陽(yáng)性淋巴結(jié)N1期,

C.陽(yáng)性淋巴結(jié)N2期,D.陽(yáng)性淋巴結(jié)N3期

2.6 CDK16在食管鱗癌細(xì)胞及淋巴結(jié)細(xì)胞中的定位

免疫組化染色結(jié)果顯示，在食管鱗癌的癌旁組織中，CDK16呈現(xiàn)出陰性染色，CDK16在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均未見(jiàn)表達(dá)，見(jiàn)圖6A；在食管鱗癌的高分化癌組織中，CDK16在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有表達(dá)，但細(xì)胞核中的表達(dá)要遠(yuǎn)遠(yuǎn)的強(qiáng)于在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)，見(jiàn)圖6B；在食管鱗癌的中分化癌組織中，CDK16在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有表達(dá)，且表達(dá)水平相差不大，見(jiàn)圖6C；在食管鱗癌的低分化癌組織中，CDK16在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有表達(dá)，但在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)要強(qiáng)于在細(xì)胞核中的表達(dá)，見(jiàn)圖6D.在食管鱗癌的陰性淋巴結(jié)(N0期)中，CDK16染色為陰性，在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均無(wú)表達(dá)，見(jiàn)圖6E.在食管鱗癌的陽(yáng)性淋巴結(jié)中，CDK16陽(yáng)性表達(dá)，且表達(dá)強(qiáng)度與腫瘤的臨床分期呈正相關(guān)；另外，在陽(yáng)性淋巴結(jié)中，CDK16在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有表達(dá)，但以核表達(dá)為主，見(jiàn)圖6F～H.

圖6 CDK16在食管鱗癌細(xì)胞中的定位(原始放大倍數(shù)×400)Fig. 6 Localization of CDK16 in esophageal squamous cell carcinoma cells (original magnification×400)

注：A.癌旁組織,B.高分化癌組織,C.中分化癌組織,

D.低分化癌組織,E.陰性淋巴結(jié)(N0期),

F.陽(yáng)性淋巴結(jié)N1期,G.陽(yáng)性淋巴結(jié)N2期,

H.陽(yáng)性淋巴結(jié)N3期

3 討論

CDK16在前列腺癌、乳腺癌、宮頸癌等多種腫瘤中具有較高的表達(dá)，而在這些腫瘤細(xì)胞中，研究者通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，RNAi介導(dǎo)的CDK16的基因沉默可以引發(fā)細(xì)胞里中心體的動(dòng)力學(xué)缺陷，從而引起有絲分裂的異常，并最終抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng).另外，研究者還證實(shí)腫瘤抑制因子p27可以與CDK16相互作用.體外激酶實(shí)驗(yàn)也表明CDK16可以在Ser10磷酸化p27.沉默CDK16可以調(diào)節(jié)p27的Ser10位點(diǎn)的磷酸化水平，并導(dǎo)致p27在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)量上升.研究者在宮頸癌HeLa細(xì)胞中的機(jī)理研究表明CDK16在細(xì)胞周期的S期和M期磷酸化p27，在一個(gè)小鼠的前列腺癌移植瘤模型中，條件性的沉默CDK16可以恢復(fù)p27的蛋白表達(dá)并抑制腫瘤生長(zhǎng).這表明，CDK16可以調(diào)節(jié)p27的穩(wěn)定性、有絲分裂和腫瘤的生長(zhǎng)，CDK16可以作為一個(gè)候選的癌癥治療靶點(diǎn)[22,23].

已有的文獻(xiàn)報(bào)道表明，CDK16在卵巢癌、前列腺癌、宮頸癌、乳腺癌、鼻咽癌中具有較強(qiáng)的表達(dá)，并通過(guò)影響腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲或凋亡等調(diào)控腫瘤的發(fā)生及發(fā)展.但是CDK16是否也參與調(diào)控食管癌的發(fā)病，目前未見(jiàn)有相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道.

本次研究結(jié)果初步揭示了CDK16與食管鱗癌之間的關(guān)系.研究結(jié)果顯示，CDK16的表達(dá)與食管癌的組織學(xué)類(lèi)型密切相關(guān).CDK16在食管腺癌及食管腺鱗癌中為弱陽(yáng)性表達(dá)，但在食管鱗癌及其兩個(gè)組織亞型基底樣食管鱗狀細(xì)胞癌及梭形食管鱗狀細(xì)胞癌中則為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá).具體到食管鱗癌，進(jìn)一步的研究結(jié)果顯示：CDK16在食管鱗癌中的表達(dá)強(qiáng)度與腫瘤的分化程度負(fù)相關(guān)，并與食管鱗癌淋巴結(jié)的臨床分期正相關(guān).這提示CDK16與食管鱗癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有著緊密的聯(lián)系.

另外，CDK16在食管鱗癌細(xì)胞核中的表達(dá)強(qiáng)度隨著腫瘤的惡性程度呈依次遞減趨勢(shì)，而在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)強(qiáng)度隨著腫瘤的惡性程度呈依次遞增趨勢(shì).我們推測(cè)，隨著腫瘤惡性程度的增強(qiáng)，CDK16在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)增強(qiáng)，這可能與腫瘤的侵襲或遷移相關(guān).

但是，本次研究還存在著諸多的不足之處，首先，樣本例數(shù)的不足.本次實(shí)驗(yàn)所收集的各個(gè)類(lèi)型食管癌的組織樣本均存在著例數(shù)不足的情況.當(dāng)然，這也與某些類(lèi)型的食管癌的病例較少有關(guān)系.第二，實(shí)驗(yàn)方法的不足.本次研究主要使用的就是組織芯片結(jié)合免疫組化的技術(shù)方法，而這對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)論的得出稍顯不足.

接下來(lái)，將進(jìn)一步深入研究本課題.一方面，擴(kuò)大樣本量，重點(diǎn)便是食管鱗癌的組織樣本.在保證例數(shù)增加的同時(shí)也要盡量保證每個(gè)病例的各項(xiàng)臨床病理參數(shù)的完整，包括患者的生存期.這樣便可以通過(guò)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析來(lái)探究CDK16的表達(dá)與食管鱗癌的各項(xiàng)臨床病理參數(shù)及病患生存期之間的關(guān)系.另一方面，通過(guò)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)來(lái)研究CDK16對(duì)食管鱗癌的各項(xiàng)細(xì)胞學(xué)功能的影響，包括細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖、細(xì)胞遷移與侵襲以及細(xì)胞凋亡等，從而進(jìn)一步地研究并闡明CDK16與食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系.