不同狼毒愈傷組織的抑菌活性及化學成分GC－MS分析

肖澤豐，李曉旭，劉名飛，朱昌叁，郝 娜，王俊麗

(中央民族大學生命與環(huán)境科學學院，北京100081)

狼毒(Stellera chamaejasme L.)又名斷腸草，是瑞香科(Thymelaeaceae)狼毒屬(Stellera)多年生草本植物［1］。有清熱解毒、消腫、瀉火等功效。狼毒主要成分有黃酮類［2］、二萜類［3－4］、香豆素類及木脂素類［5－6］，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用［7－8］。近年來有關(guān)狼毒化學成分和抗腫瘤、抗艾滋病方面的研究取得了迅速的發(fā)展，狼毒還被用于生物農(nóng)藥，以毒攻毒取得了明顯的效果?，F(xiàn)階段國內(nèi)研究可采用組織培養(yǎng)技術(shù)，通過添加不同植物生長調(diào)節(jié)劑的方式，可刺激狼毒的次生代謝產(chǎn)物的積累，提高有效藥物成分的含量。

本研究對不同生長調(diào)節(jié)劑培養(yǎng)條件下的狼毒愈傷組織進行乙醇提取，通過抑菌圈法探究醇提物對大腸桿菌(Escherichia coli)、四疊球菌(Micrococcus tetragenus)、白色葡萄球菌(Staphylococcus albus)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的抑菌活性進行了分析，并通過GC－MS分析其化學成分，以期得出不同植物生長調(diào)節(jié)劑對其抑菌活性和成分積累的影響，為狼毒的科學應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與菌種

野生狼毒植株采自北京市東靈山海拔1 800 m左右的向陽山坡上。所用菌種為大腸桿菌、四疊球菌、白色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌。

1.2 方法

1.2.1 愈傷組織醇提物的制備 以狼毒葉片為外植體，通過添加不同濃度的萘乙酸(NAA)、6－芐氨基腺嘌呤(6－BA)、苯基噻二唑基脲(TDZ)、激動素(KT)、2，4－二氯苯氧乙酸(2，4－D)等生長調(diào)節(jié)劑進行培養(yǎng)，誘導愈傷組織。將誘導出的愈傷組織于50℃條件下烘干、粉碎并稱質(zhì)量，用95%的乙醇(材料與乙醇比為1∶20)30℃條件下浸提3次，抽濾，風干，計算產(chǎn)率。

1.2.2 抑菌活性的測定

1.2.2.1 抑菌實驗樣品及對照品的配制 稱取一定量的乙醇提取物，配制成為100.00 mg/mL的甲醇溶液，再分別以甲醇為溶劑配制成為5.00 mg/mL和10.00 mg/mL的溶液;配制5.00 mg/mL和10.00 mg/mL的青霉素鈉溶液。

1.2.2.2 菌懸液的制備 將大腸桿菌、四疊球菌、白色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌接種培養(yǎng)(37℃搖床活化培養(yǎng)24 h)后，用無菌生理鹽水稀釋成含菌量為106～107CFU/mL的菌懸液備用。

1.2.2.3 抑菌圈法測定 將直徑為0.6 cm的無菌濾紙片貼在已涂布0.2 mL菌懸液的培養(yǎng)基上，用移液槍在每個濾紙片上加入20μL不同濃度的甲醇樣品溶液，37℃恒溫培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈直徑。重復3次，取平均值。青霉素鈉作為陽性對照。

1.2.3 樣品的GC－MS分析

1.2.3.1 柱前衍生化 取一定量乙醇提取物于1.5 mL離心管，加入足量無水CaCl2，75℃放置1 h使提取物徹底干燥。每份樣品加入250μL硅烷化試劑［雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)與吡啶比為5∶1］，75℃衍生化1.5 h。

1.2.3.2 測試條件 使用AGILENT 5975/6890N型氣質(zhì)聯(lián)用儀測定提取物的化學組分。毛細管柱為 HP－35 ms(30.0 m × 0.25 mm × 0.25 μm)，載 氣 為 He，流 速 為1 mL/min，進樣量為1μL，進樣口溫度為280℃。測定程序:柱溫60℃，保持1 min;10℃/min升溫至180℃，保持1 min;再以20℃/min升溫至280℃，保持5 min。質(zhì)譜條件:電子轟擊源(EI)，電壓70 eV，掃描范圍20～800 u，根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫NISTOS結(jié)合標準化合物，進行乙醇提取物主要成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同材料醇提物的產(chǎn)率

由表1可知，生長調(diào)節(jié)劑影響著醇提物的產(chǎn)率，30個愈傷組織樣品中有25個產(chǎn)率高于MS培養(yǎng)基誘導的愈傷組織的產(chǎn)率，培養(yǎng)基中加入NAA 2.0 mg/L的樣品21產(chǎn)率最高，為23.27%，加入 KT 2.0 mg/L的樣品 25產(chǎn)率最低，為6.47%。研究結(jié)果表明。NAA 2.0 mg/L最有利于愈傷組織干物質(zhì)積累。

表1 不同材料醇提物的產(chǎn)率

2.2 抑菌活性的測定

2.2.1 不同樣品對大腸桿菌的抑制作用 對32個樣品進行了抑菌活性分析，研究發(fā)現(xiàn)4、24、25、MS、W這5個樣品對大腸桿菌的抑制效果好(表2)。其中W(野生狼毒根)各濃度抑菌效果最強，其最小抑菌濃度(MIC)為0.78 mg/mL;其次是樣品25(添加KT 2.0 mg/L)與MS(無生長調(diào)節(jié)劑)，MIC均為12.50 mg/mL;樣品 4(添加 NAA 1.0 mg/L+6 －BA 0.5 mg/L)和樣品 24(添加 KT 1.0 mg/L)的 MIC 均為25.00 mg/mL，抑菌活性最差。

2.2.2 不同樣品對四疊球菌的抑制作用 32個樣品中8、10、28、MS、W這5個樣品抑制四疊球菌效果較好。其中樣品W(野生狼毒根)的MIC為3.13 mg/mL，抑菌效果最好;樣品8(添加 NAA 0.5 mg/L+TDZ 2.0 mg/L)的 MIC 為25.00 mg/mL;樣品10(添加 NAA 2.0 mg/L+TDZ 2.0 mg/L)與樣品28(添加2，4 －D 1.0 mg/L)的 MIC 均為12.50 mg/mL。樣品MS(無生長調(diào)節(jié)劑)在濃度為6.25 mg/mL時，就具有抑菌活性，與野生根相差最小。

2.2.3 不同樣品對金黃色葡萄球菌的抑制作用 通過研究發(fā)現(xiàn)，8、10、14、25、28、W 這 6 個樣品抑制金黃色葡萄球菌效果較好。其中效果最好的為 W(野生狼毒根)，其 MIC為1.56 mg/mL;樣品 10(添加 NAA 2.0 mg/L+TDZ 2.0 mg/L)與樣品28(添加2，4 －D 1.0 mg/L)的MIC 均為6.25 mg/mL;樣品 8(添加 NAA 0.5 mg/L+TDZ 2.0 mg/L)、樣品 14(添加TDZ 4.0 mg/L)和樣品 25(添加 KT 2.0 mg/L)的 MIC 約為12.50 mg/mL;在較高濃度下，樣品8、10、14 和28 的抑菌圈較大，抑菌效果隨著濃度的降低顯著下降。而W(野生狼毒根)的抑菌圈大小則是隨濃度的減小有先增加后降低的趨勢，說明野生狼毒根醇提物在一定濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出較強的抑菌活性。由表4可知，對金黃色葡萄球菌的抑菌活性最好的為樣品10和樣品28。

表2 不同樣品對大腸桿菌的抑菌作用

表3 不同樣品對四疊球菌的抑制作用

表4 不同樣品對金黃色葡萄球菌的抑制作用

2.2.4 不同樣品對枯草芽孢桿菌的抑制作用 在32個樣品中，4、22、MS、W這4個樣品抑制枯草芽孢桿菌效果較好。其中效果最好的為樣品 W(野生狼毒根)，其 MIC為3.13 mg/mL;樣品 MS 的 MIC 為 6.25 mg/mL;樣品 4(添加NAA 1.0+6 －BA 0.5 mg/L)與樣品22(添加 NAA 4.0 mg/L)的MIC分別為12.50 mg/L和25.00 mg/mL(表5)。

表5 不同樣品對枯草芽孢桿菌的抑制作用

2.2.5 不同樣品對白色葡萄球菌的抑制作用 研究表明，4、8、17、21、22、24、25、W 這 8 個樣品抑制白色葡萄球菌效果較好。其中效果最好的為 W(野生狼毒根)，其 MIC為0.39 mg/mL;其次是樣品25(添加 KT 2.0 mg/L)與樣品8(添加 NAA 0.5 mg/L+TDZ 2.0 mg/L)，其 MIC 均為3.13 mg/mL;樣品4(添加 NAA 1.0 mg/L+6 －BA 0.5 mg/L)、樣品21(添加 NAA 2.0 mg/L)和樣品22(添加NAA 4.0 mg/L)的MIC 均為 6.25 mg/mL;樣品 17(添加 6 －BA 2.0 mg/L)的 MIC 為12.50 mg/mL;樣品24(添加 KT 1.0 mg/L)的抑菌效果最差，MIC 為25.00 mg/mL(表6)。

2.2.6 不同樣品的GC－MS分析 如表7所示，多個樣品含有短鏈的醇和酸，并且相對含量差異較大，如丁二酸在樣品25中的相對含量為10.426%，但在樣品4中則只有0.068%，說明添加KT 2.0 mg/L的培養(yǎng)基有利于狼毒愈傷組織產(chǎn)生丁二酸。在樣品4、8、13及21中均檢測到木脂素類化合物，其中樣品 8的相對含量最高，為 9.740%，說明 MS+NAA 0.5 mg/L+TDZ 2.0 mg/L培養(yǎng)基有利于木脂素的積累。

在樣品 21、25、29及 W 中檢測到甾醇類，添加 KT 2.0 mg/L的培養(yǎng)基中樣品相對含量最高，為1.225%，高于W的含量(0.857%)。已有研究表明植物甾醇在降低血液膽甾醇含量、抑制腫瘤、防治前列腺肥大、抑制乳腺增生和調(diào)節(jié)免疫等方面都有重要作用［8］。葡萄籽油屬于多酚類，是強抗氧化物質(zhì)，對冠心病和骨質(zhì)疏松癥都有良好的預防作用。在所測樣品中，只有樣品25和W含有，而且在樣品25中的相對含量為1.839%，高于樣品W的含量(0.767%)。

表6 不同樣品對白色葡萄球菌的抑制作用

表7 不同樣品的化學成分及相對含量

另外，樣品8中所檢測到的成分多為氨基酸和醇類、酸類，說明添加NAA 0.5 mg/L與TDZ 2.0 mg/L的培養(yǎng)基較其他類型培養(yǎng)基更利于氨基酸的積累。樣品4中檢測到表兒茶素，表明添加NAA 1.0 mg/L與6－BA 0.5 mg/L的培養(yǎng)基更有利于黃酮類的積累。

3 結(jié)論

植物生長調(diào)節(jié)劑對愈傷組織醇提物的抑菌活性有很大影響。培養(yǎng)基中添加KT 2.0 mg/L所誘導的愈傷組織(樣品25)對大腸桿菌的抑制效果好，培養(yǎng)基中添加NAA 2.0 mg/L+TDZ 2.0 mg/L(樣品10)和添加 2，4 －D 1.0 mg/L(樣品 28)抑制四疊球菌和金黃色葡萄球菌效果較好，培養(yǎng)基中添加NAA 0.5 mg/L+TDZ 2.0 mg/L(樣品 8)和 KT 2.0 mg/L(樣品25)抑制白色葡萄球菌效果較好，培養(yǎng)基中添加NAA 1.0 mg/L+6－BA 0.5 mg/L(樣品4)抑制枯草芽孢桿菌效果較好。

植物生長調(diào)節(jié)劑對愈傷組織中化合物的合成與積累有一定的影響。NAA 0.5 mg/L與TDZ 2.0 mg/L有利于氨基酸和木脂素類化合物的積累。NAA 1.0 mg/L與6－BA 0.5 mg/L的培養(yǎng)基有利于黃酮類化合物的積累，KT 2.0 mg/L有利于甾醇類的積累。