喂食當(dāng)歸多糖對(duì)點(diǎn)帶石斑魚抗氧化酶活力及其基因表達(dá)的影響

劉 波，王慶奎，邢克智，陳成勛

(天津市水產(chǎn)生態(tài)與養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，天津300384)

點(diǎn)帶石斑魚(Epinephelus malabaricus)隸屬鱸形目(Perciformes)科(Serranidae)，廣泛分布于中國(guó)東南沿海。點(diǎn)帶石斑魚對(duì)環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)、肉質(zhì)鮮美，含有豐富的高不飽和脂肪酸，是一種低脂肪、高蛋白的上等食用魚［1］，被中國(guó)港澳地區(qū)推為中國(guó)四大名魚之一，素有“海雞肉”之稱。伴隨著石斑魚集約化養(yǎng)殖的興起，石斑魚健康水平下降，細(xì)菌性、病毒性疾病頻發(fā)［2－3］。而常用的化學(xué)消毒劑和抗生素等藥物，不僅導(dǎo)致病原微生物產(chǎn)生耐藥性［4］，而且少量藥物也殘留在石斑魚體內(nèi)［5］，對(duì)人體健康有潛在的危害。

許多中草藥多糖具有生物安全、可降解、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，能提高水產(chǎn)動(dòng)物免疫力和抗病力，在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中受到廣泛關(guān)注［6］，抗氧化系統(tǒng)是非特異性免疫的重要組成部分，較強(qiáng)的抗氧化能力有助于機(jī)體免疫力的提高。研究發(fā)現(xiàn)，中草藥多糖可通過調(diào)節(jié)抗氧化酶活性和相關(guān)抗氧化基因的表達(dá)，來提高對(duì)抗活性氧自由基的能力，飼料中添加牛膝多糖(Achyranthes bidentata)能提高草魚(Grass carp)SOD、CAT活力，降低 MDA含量［7］。對(duì)擬穴青蟹(Scylla Paramamosain)注射大黃多糖(Rheum palmatum L)后發(fā)現(xiàn)，過氧化氫酶、過氧化物還原酶、酚氧化酶原等免疫基因分別在血細(xì)胞和肝胰腺中明顯上調(diào)，推測(cè)可能與擬穴青蟹免疫增強(qiáng)有關(guān)［8］。

當(dāng)歸多糖(Angelica sinensis polysaccharide，ASP)是傘形科植物當(dāng)歸的主要活性成分之一［9］。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸多糖能通過提高血液白細(xì)胞的吞噬能力和頭腎白細(xì)胞的增殖能力，并促進(jìn)點(diǎn)帶石斑魚的呼吸爆發(fā)活力、吞噬活力、降低遲緩愛德華菌(Edwardsiella tarda)攻毒后試驗(yàn)魚的累計(jì)死亡率來提高點(diǎn)帶石斑魚的非特異性免疫力和抗病力［10－11］。通過激活TLR22及其下游相關(guān)基因Toll樣接頭蛋白TRIF，干擾素調(diào)節(jié)因子IRF3主要組織相容性復(fù)合體(MHC)與腫瘤壞死因子(TNF－α)、白介素－8(IL－8)的方式調(diào)節(jié)石斑魚的免疫功能［12］。改善抗氧化能力是多糖調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力的機(jī)理之一［13］，通過體外試驗(yàn)證實(shí)當(dāng)歸多糖能夠有效清除對(duì)生物體毒性強(qiáng)、危害大的超氧陰離子自由基和羥基自由基，抑制脂質(zhì)過氧化［14］，但當(dāng)歸多糖對(duì)魚類抗氧化能力方面的研究較少，本試驗(yàn)研究當(dāng)歸多糖對(duì)點(diǎn)帶石斑魚CuZn－SOD、Mn－SOD、CAT抗氧化活力以及相關(guān)基因CuZn－SOD、Mn－SOD、CAT mRNA的表達(dá)量的影響，為揭示當(dāng)歸多糖調(diào)節(jié)點(diǎn)帶石斑魚抗氧化能力的機(jī)理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用點(diǎn)帶石斑魚(89.61±2.08)g由天津市海發(fā)珍品實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司提供。當(dāng)歸購(gòu)于天津市當(dāng)?shù)刂胁菟幨袌?chǎng)，產(chǎn)地甘肅。本試驗(yàn)采用水提醇沉的方法［15］提取當(dāng)歸多糖(ASP)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇健康且大小相近的點(diǎn)帶石斑魚450尾魚隨機(jī)分配到15個(gè)玻璃鋼水槽(86 cm×62 cm×45.5 cm)，每個(gè)水槽30尾，將 ASP 按0、2 000、4 000、6 000、8 000 mg/kg 添加到基礎(chǔ)飼料(表1)中，每種飼料喂食3槽試驗(yàn)魚，連續(xù)投喂42 d后采樣。每組每次采樣12尾，取樣前停食24 h，取樣魚用MS－222麻醉，用0.2 mL無菌注射器尾靜脈取血，用8%肝素鈉抗凝，收集血漿(4℃，4 000 r/min離心15 min);將采血后的試驗(yàn)魚進(jìn)行解剖，取肝胰臟，－80℃冰箱中保存。測(cè)定血漿和肝胰臟 CuZn－SOD、Mn－SOD、CAT酶活力和 CuZn－SOD、Mn－SOD、CAT基因表達(dá)量。

表1 試驗(yàn)餌料配方及其營(yíng)養(yǎng)成分

表2 引物序列

1.3 試驗(yàn)條件和日常管理

試驗(yàn)水槽安置在石斑魚室內(nèi)工廠化養(yǎng)殖的水泥池中。試驗(yàn)用海水為石斑魚循環(huán)水養(yǎng)殖用水，海水經(jīng)生物包處理、充純氧，紫外線消毒后，以0.3～0.8 m/s流速流入飼養(yǎng)水槽，過多的海水從出水管溢出，不再使用。試驗(yàn)期間水質(zhì)條件為:水溫26.5 ～27.8 ℃，鹽度23% ～26%，溶氧量 8.24 ～8.52 mg/L，pH 值7.2 ～8.6，銨態(tài)氮(－N)含量0.009 ～0.011 mg/L，亞硝態(tài)氮(NO2－N)0.023～0.028 mg/L。每日 08:00 和16:00各投喂1次，每次飽食投喂，并避免產(chǎn)生殘餌。

1.4 抗氧化指標(biāo)

血漿及肝胰臟中的超氧化物歧化酶(CuZn－SOD和Mn－SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性采用南京建成生物研究所生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定。

1.5 總RNA提取和cDNA的合成

用Trizol試劑(大連寶生物工程有限公司)提取肝胰臟中的總 RNA。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒 PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)合成cDNA第1條鏈，反應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品說明書進(jìn)行。經(jīng)測(cè)濃度后的樣本按個(gè)人要求選擇反轉(zhuǎn)錄的用量，10μL反應(yīng)體系中保證總 RNA的量在500 ng以下。在200μL離心管中加入2μL 5×PrimeScript RT Master Mix和個(gè)人所需的RNA模板溶液，最后用ddH2O將溶液補(bǔ)齊至10μL。反應(yīng)條件:37℃保溫15 min，85℃保溫5 s，然后置于4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 肝胰臟 CuZn－SOD、Mn－SOD、CATm RNA表達(dá)水平測(cè)定

1.6.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GeneBank已上傳的斜帶石斑魚的CAT序列(AY735009.1)、Mn － SOD 序列(AY735007.1)、CuZn－SOD序列(AY035854.1)和已上傳的赤點(diǎn)石斑魚的β－actin序列(HQ007251.1)，利用序列間的保守區(qū)域設(shè)計(jì)用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物(表2)，引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.6.2 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 按照 SYBR Premix Dimer EraserTM(Perfect Real Time)試劑盒說明書操作。PCR擴(kuò)增體系為20 μL，包括 10 μL SYBR Premix Dimer EraserTM、0.5 μL上游引物、0.5μL下游引物、2μL cDNA和 7μL ddH2O。

PCR反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性3 min;95℃變性15 s，退火60 s，72 ℃延伸2 min，循環(huán)40 次。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

CuZn－SOD、Mn－SOD、CATm RNA的表達(dá)以β－actin為內(nèi)參，參照對(duì)照組mRNA表達(dá)量，應(yīng)用2－ΔΔCt計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。數(shù)據(jù)采用用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，作單因素方差分析，采用Duncan's法進(jìn)行多重比較，p＜0.05表示差異顯著。數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示(n=3)。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 提取的RNA質(zhì)量

測(cè)定的D260nm/D280nm的比值在1.8～2.1之間，可以說明提取的RNA純度較高，符合試驗(yàn)要求。瓊脂糖凝膠電泳5S rRNA、18SrRNA、28SrRNA 3條條帶清晰完整(圖1)。

2.2 CuZn－SOD酶活力及基因

由圖 2－A、圖 2－B可知，喂食 42 d后，血漿8 000 mg/kg組與處理組差異不顯著，其他組顯著低于對(duì)照組;肝胰臟CuZn－SOD酶活力在6 000 mg/kg處理組顯著高于對(duì)照組，其他組顯著低于對(duì)照組。

由圖2－C可知，喂食42 d后，隨ASP添加量的升高，CuZn－SOD基因表達(dá)量先降低后升高再降低，6 000 mg/kg明顯高于對(duì)照組，2 000、4 000 mg/kg明顯低于對(duì)照組。

2.3 Mn－SOD酶活力以及基因

由圖3－A、圖3－B可知，喂食42 d后，隨ASP添加量的升高，血漿處理組Mn－SOD酶活力先降低后升高再降低，2 000 mg/kg組明顯低于對(duì)照組，其他組與對(duì)照組無顯著差異;肝胰臟Mn－SOD酶活力先升高后降低再升高，各處理組均明顯高于對(duì)照組，在2 000 mg/kg達(dá)到最大值。

由圖3－C可知，喂食42 d后，Mn－SOD基因表達(dá)量在6 000 mg/kg明顯大于對(duì)照組及其他組，在2 000、8 000 mg/kg明顯低于對(duì)照組。

2.4 CAT抗氧化酶活力以及基因

由圖4－A、圖4－B可知，喂食42 d后，血漿CAT酶活力在8 000 mg/kg明顯小于對(duì)照組，其他組與對(duì)照組差異不顯著;肝胰臟中各處理組隨ASP添加量的升高CAT酶活力先升高后降低，2 000、6 000 mg/kg處理組顯著高于對(duì)照組，其他組與對(duì)照組差異不顯著。

由圖4－C可知，喂食42 d后，6 000 mg/kg組CAT基因表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，其他組與對(duì)照組差異不顯著。

3 討論

超氧化物歧化酶(SOD)作為活性氧清除劑參與清除體內(nèi)自由基，與水生生物的免疫水平密切相關(guān)，對(duì)于增強(qiáng)整個(gè)機(jī)體的免疫功能具有重要作用［16］。研究發(fā)現(xiàn)，汪開毓等以鯽魚(Crucain carp)為研究對(duì)象，投喂無花果(Ficus carica)多糖后可顯著提高其血液SOD活性［17］;白東清等證實(shí)，長(zhǎng)期投喂黃芪(Astraglusseu)多糖可顯著黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)頭腎和肌肉中 SOD酶活力［18］;李春震等對(duì)黑鯛(Sparus inacrocephalus)投喂不同濃度的人參多糖飼料后發(fā)現(xiàn)，人參多糖能顯著提高黑鯛SOD基因表達(dá)量［19］。本試驗(yàn)中，隨著ASP添加量的升高，肝胰臟CuZn－SOD酶活力及其基因表達(dá)量均呈現(xiàn)先降低后升高再降低的趨勢(shì)，肝胰臟Mn－SOD酶活力呈現(xiàn)先升高后降低再升高，Mn－SOD基因表達(dá)量先降低后升高再降低，綜合來看，添加量在6 000 mg/kg時(shí)肝胰臟CuZn－SOD、Mn－SOD酶活力和基因表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，這與高穎暉等報(bào)道的小鼠補(bǔ)充殼聚糖(chitosan)，能夠增加力竭運(yùn)動(dòng)小鼠肝組織SOD酶活性和基因表達(dá)量活性的研究結(jié)果［20］一致，基因表達(dá)量可以提高其編碼蛋白的表達(dá)量，從而提高相應(yīng)酶活力［21］，當(dāng)歸多糖可通過上調(diào)CuZn－SOD、Mn－SOD基因表達(dá)來提高點(diǎn)帶石斑魚CuZn－SOD、Mn－SOD酶活力，促進(jìn)機(jī)體免疫機(jī)制保護(hù)機(jī)體免受損傷。研究發(fā)現(xiàn)，ASP添加量在2 000、4 000 mg/kg時(shí)，血漿、肝胰臟 CuZn－SOD酶活力和基因表達(dá)量均明顯小于對(duì)照組，推測(cè)是當(dāng)歸多糖濃度過低，無法達(dá)到對(duì)基因表達(dá)所需的濃度范圍，對(duì)抗氧化系統(tǒng)的產(chǎn)生干擾，從而抑制了 CuZn－SOD基因的表達(dá)，使 CuZn－SOD mRNA轉(zhuǎn)錄水平降低，進(jìn)而使CuZn－SOD蛋白合成減少，CuZn－SOD酶活力降低。

過氧化氫酶(CAT)是機(jī)體內(nèi)不需要特殊供體而能夠執(zhí)行的第一道抗氧化防線任務(wù)的重要抗氧化酶。試驗(yàn)結(jié)果顯示，喂食當(dāng)歸多糖6 000 mg/kg時(shí)能顯著提高肝胰臟CAT酶活力和CAT表達(dá)量，與SOD結(jié)果一致，這可能與兩者之間的功能有關(guān)，SOD和CAT是反映有機(jī)體抗氧化能力的2個(gè)重要指標(biāo)，前者催化超氧化物歧化為過氧化氫，后者催化過氧化氫還原成水和氧，兩者酶活力具有一定的同步性［22］，活性氧產(chǎn)生后，CAT活力量隨SOD活力及其反應(yīng)產(chǎn)物的增加而相應(yīng)提高，將過氧化氫還原，從而降低組織過氧化損傷。類似地，血鸚鵡攝食牛膝(Achyranthes bidentata)多糖后，羅非魚攝食黃芪多糖后，SOD和CAT活力也表現(xiàn)出一致性［23－24］。

綜上所述，當(dāng)歸多糖能顯著影響點(diǎn)帶石斑魚肝胰臟CuZn－SOD、Mn－SOD、CAT酶活力，并且在 6 000 mg/kg顯著上調(diào)CuZn－SOD、Mn－SOD、CAT基因的表達(dá)量。

致謝:感謝天津農(nóng)學(xué)院王曉梅教授、石洪玥實(shí)驗(yàn)師和天津市海發(fā)珍品實(shí)業(yè)有限公司在本試驗(yàn)石斑魚養(yǎng)殖過程中提供的幫助，對(duì)此深表謝意!