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    碳、氮源對(duì)猴頭菌菌絲和子實(shí)體生長(zhǎng)及胞外酶的影響

    2018-10-16 07:13:48范博文龔教龍林俊俊石新新唐春雙王智慧李佐同楊克軍趙長(zhǎng)江
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018年18期
    關(guān)鍵詞:猴頭菌羧甲基氮源

    范博文,龔教龍,林俊俊,趙 瑩,石新新,唐春雙,王智慧,李佐同,楊克軍,趙長(zhǎng)江

    (黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院/寒地作物種質(zhì)改良與栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江大慶163319)

    猴頭菌(Hericium erinaceus)是我國(guó)珍貴的食藥兼用真菌[1],屬于猴菇目猴菇科猴菇屬[2]。猴頭菌味道鮮美,營(yíng)養(yǎng)豐富,有“山珍猴頭、海味燕窩”之稱。近幾年,隨著市場(chǎng)需求的增大,人們對(duì)猴頭菌的研究也不斷加大。但研究主要集中在栽培技術(shù)方面,對(duì)猴頭菌的生理特性研究較少,且不具有系統(tǒng)性。趙占國(guó)等認(rèn)為猴頭菌菌絲生長(zhǎng)最適宜的碳源為葡萄糖和甘露糖,麥芽糖、淀粉、乳糖等次之[3]。石勇民等認(rèn)為猴頭菇菌絲在蛋白胨作為氮源的培養(yǎng)基中干質(zhì)量最大,酵母膏次之,并且對(duì)于有機(jī)氮的利用效果強(qiáng)于無(wú)機(jī)氮[4]。何錦星通過(guò)利用棉籽殼和酒渣2種不同培養(yǎng)料栽培猴頭菌,將所得到的兩種子實(shí)體與野生猴頭菌子實(shí)體進(jìn)行對(duì)比,發(fā)現(xiàn)三者品質(zhì)都不同,表明了不同營(yíng)養(yǎng)對(duì)猴頭菌子實(shí)體品質(zhì)有一定影響[5]。目前,對(duì)猴頭菌所需不同種類碳、氮源的研究主要集中在菌絲期,原因是按照傳統(tǒng)方法單一碳、氮源固體培養(yǎng)很難形成子實(shí)體,而吳政聲用液體培養(yǎng)在9種食用菌中做出菇試驗(yàn),成功形成子實(shí)體[6]。將液體培養(yǎng)與探究碳、氮源對(duì)猴頭菌營(yíng)養(yǎng)利用相結(jié)合,能更深一步了解不同營(yíng)養(yǎng)對(duì)猴頭菌理化性質(zhì)的影響。本試驗(yàn)通過(guò)探究不同碳、氮源對(duì)猴頭菌菌絲和子實(shí)體生長(zhǎng)以及胞外酶的影響,為猴頭菌營(yíng)養(yǎng)利用規(guī)律提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 供試菌株

    猴頭菌(Hericium erinaceus)菌株RT22由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院牡丹江分院提供。

    1.2 培養(yǎng)基

    基礎(chǔ)培養(yǎng)基(蛋白胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基):蛋白胨2.0 g,葡萄糖 20.0 g,磷酸氫二鉀 1.0 g,硫酸鎂 0.5 g,磷酸二氫鉀0.5 g,維生素 B10.5 g,瓊脂 20.0 g,水 1 000.0 mL。

    碳源固體培養(yǎng)基:將基礎(chǔ)培養(yǎng)基中葡萄糖分別用供試碳源(麥芽糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖、淀粉、纖維素、果糖)替代,供試碳源濃度為20 g/L。

    碳源液體培養(yǎng)基:去掉固體培養(yǎng)基配方中瓊脂,并將基礎(chǔ)培養(yǎng)基中葡萄糖分別用供試碳源(麥芽糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖、淀粉、纖維素、果糖)替代。供試碳源濃度為20 g/L。

    氮源固體培養(yǎng)基:將基礎(chǔ)培養(yǎng)基中蛋白胨分別用供試氮源(苯丙氨酸、谷氨酰胺、硝酸銨、尿素、蛋白胨、酵母膏、酵母浸粉)替代,供試氮源濃度為2 g/L。

    氮源液體培養(yǎng)基:去掉固體培養(yǎng)基配方中瓊脂,并將基礎(chǔ)培養(yǎng)基中蛋白胨分別用供試氮源(苯丙氨酸、谷氨酰胺、硝酸銨、尿素、蛋白胨、酵母膏、酵母浸粉)替代,供試氮源濃度為2 g/L。

    1.3 猴頭菌生長(zhǎng)試驗(yàn)

    1.3.1 猴頭菌菌絲生長(zhǎng)試驗(yàn) 菌種活化后,取直徑5 mm的菌種塊,接種到固體培養(yǎng)基上,溫度25℃避光培養(yǎng),之后測(cè)定菌絲生長(zhǎng)指標(biāo)。試驗(yàn)均采用直徑90 mm的培養(yǎng)皿,其中培養(yǎng)基用量20 mL/皿。每個(gè)處理3次重復(fù)。

    1.3.2 猴頭菌子實(shí)體原基生長(zhǎng)試驗(yàn) 菌種活化后,取直徑5 mm的菌種塊,接種到液體培養(yǎng)基中(每瓶接種10個(gè)菌種塊),溫度25℃避光培養(yǎng)20 d后,測(cè)定菌絲生長(zhǎng)指標(biāo)。菌絲移入溫度18℃、光照800~1 000 lx條件下出菇。出菇期第25天(此時(shí)形成子實(shí)體處理中九成達(dá)到要求)收集子實(shí)體原基,測(cè)定其品質(zhì);吸取培養(yǎng)液,8 000 r/min、4℃離心10 min,取上清液測(cè)定其酶活性。每個(gè)處理3次重復(fù)。1.4 指標(biāo)測(cè)定

    1.4.1 生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定 固體培養(yǎng)第15天測(cè)菌絲生長(zhǎng)速度,固體和液體培養(yǎng)第20天,取菌絲(固體菌絲用刀片刮下)80℃ 烘干至恒質(zhì)量,稱取干重。

    1.4.2 子實(shí)體原基品質(zhì)相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

    1.4.2.1 還原糖含量測(cè)定 取3 g樣品,加入50 mL蒸餾水,置于50℃恒溫水浴中保溫20 min,使還原糖浸出,定容至100 mL。在U3900型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日立)540 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度[7]。

    1.4.2.2 可溶性糖含量測(cè)定 取干樣0.1 g,加5 ml蒸餾水,沸水中提取30 min,提取液過(guò)濾定容至25 mL容量瓶中。吸取樣品提取液0.5 mL于20 mL刻度試管中,加蒸餾水1.5 mL,在U3900型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)630 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度[7]。

    1.4.2.3 蛋白含量測(cè)定 取0.5 g樣品,加入2 mL蒸餾水,研磨制勻漿,再加6 mL蒸餾水洗滌后轉(zhuǎn)移到離心管,室溫放置0.5 ~1.0 h 充分提取,然后在4 000 r/min 離心20 min,轉(zhuǎn)移上清液并定容至10 mL容量瓶中,即為提取液。取0.1 mL提取液,加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250蛋白試劑,放置2 min后,在U3900型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)以595 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度[7]。

    1.4.3 胞外酶活力測(cè)定

    1.4.3.1 羧甲基纖維素酶活性測(cè)定 取0.5 mL酶液和1.5 mL pH值為4.6的羧甲基纖維素鈉溶液混合,置于40℃水浴鍋保溫30 min。沸水中煮沸15 min后,取0.5 mL用DNS法測(cè)還原糖生成量。U3900型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)以540 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度[7]。

    1.4.3.2 半纖維素酶活性測(cè)定 將0.5 mL酶液和1 mL 1% 的木聚糖溶液混勻后,在50℃水浴鍋保溫1 h,取出加入2 mL DNS試劑,煮沸5 min。取出待定容至20 mL,以煮沸滅活的酶液作對(duì)照在U3900型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度[8]。

    1.4.3.3 淀粉酶活性測(cè)定 將 0.5 mL pH 值為 5.6的0.1 mol/L檸檬酸緩沖液和0.5 mL酶液混合勻后40℃水浴15 min,加入40℃ 1%的可溶性淀粉1 mL,混勻,40℃水浴5 min,加入2 mL 0.4 mol/L NaOH。取混合溶液2 mL和2 mL DNS試劑,煮沸5 min,取出冷卻,加入蒸餾水定容至25 mL,在U3900型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)520 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度[9]。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同碳、氮源對(duì)猴頭菌菌絲生長(zhǎng)的影響

    研究發(fā)現(xiàn),不同碳源處理對(duì)猴頭菌絲生長(zhǎng)有明顯影響(圖1,表1)。幾種碳源菌絲日均生長(zhǎng)速度從高到低順序是果糖>葡萄糖>蔗糖>麥芽糖>淀粉>乳糖>纖維素。其中,以果糖或葡萄糖為碳源,猴頭菌菌絲生長(zhǎng)較好,菌絲日均生長(zhǎng)速度分別為0.54、0.51 cm/d。以纖維素為碳源,猴頭菌菌絲生長(zhǎng)最差,菌絲日均生長(zhǎng)速度為0.15 cm/d。

    不同氮源處理對(duì)猴頭菌絲生長(zhǎng)也有明顯影響(圖1,表2)。幾種氮源菌絲日均生長(zhǎng)速度從高到低順序是酵母浸粉>酵母膏>蛋白胨>谷氨酰胺>硝酸銨>苯丙氨酸>尿素。其中,以酵母浸粉、酵母膏和蛋白胨為氮源,猴頭菌菌絲生長(zhǎng)較好,菌絲日均生長(zhǎng)速度分別為 0.56、0.54、0.51 cm/d。以尿素為氮源,猴頭菌菌絲生長(zhǎng)最差,菌絲日均生長(zhǎng)速度為 0.03 cm/d。

    表1 不同碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度的影響

    2.2 不同碳、氮源對(duì)猴頭菌子實(shí)體原基品質(zhì)的影響

    將猴頭菌進(jìn)行液體培養(yǎng)后,只有葡萄糖、蔗糖、蛋白胨、酵母浸粉、酵母膏5個(gè)處理可以形成子實(shí)體原基。因此,僅對(duì)這5個(gè)處理的子實(shí)體原基品質(zhì)進(jìn)行測(cè)定。

    2.2.1 不同碳、氮源對(duì)猴頭菌子實(shí)體原基還原糖含量的影響還原糖是指具有還原性的糖類,包括葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、麥芽糖等。研究發(fā)現(xiàn),氮源的還原糖含量高于碳源的還原糖含量,酵母浸粉和酵母膏的還原糖含量較高,且酵母浸粉的還原糖含量最高。葡萄糖、蔗糖和蛋白胨的還原糖含量較低,顯著低于酵母浸粉和酵母膏,且蔗糖的還原糖含量最低(圖2)。

    表2 不同氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度的影響

    2.2.2 不同碳、氮源對(duì)猴頭菌子實(shí)體原基可溶性糖含量的影響 可溶性糖就是易溶于水的糖,包括絕大部分的單糖、寡糖。研發(fā)發(fā)現(xiàn),酵母膏可溶性糖的含量最高,顯著高于其他處理;蔗糖的可溶性糖含量次之;酵母浸粉、葡萄糖和蛋白胨可溶性糖含量在同一水平,且蛋白胨的可溶性糖含量最低(圖3)。

    2.2.3 不同碳、氮源對(duì)猴頭菌子實(shí)體原基可溶性蛋白含量的影響 可溶性蛋白指可以以小分子狀態(tài)溶于水或其他溶劑的蛋白,是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn),整體來(lái)看,氮源處理的可溶性蛋白含量低于碳源處理。蔗糖處理的可溶性蛋白含量最高,顯著高于其他處理;葡萄糖和蛋白胨處理處于同一水平,可溶性蛋白含量?jī)H次于蔗糖處理;酵母膏處理的可溶性蛋白含量最低(圖4)。

    2.3 猴頭菌菌絲固體培養(yǎng)與液體培養(yǎng)干質(zhì)量比較

    試驗(yàn)結(jié)果表明,菌絲固體培養(yǎng)與液體培養(yǎng)具有較高的相關(guān)性。碳源菌絲干質(zhì)量由大到小順序?yàn)槠咸烟牵竟牵菊崽牵钧溠刻牵镜矸郏纠w維素>乳糖,其r2值為0.958 4。氮源菌絲干質(zhì)量由大到小順序?yàn)榻湍附郏窘湍父啵镜鞍纂耍竟劝滨0罚鞠跛徜@>尿素>苯丙氨酸,其r2值為0.904 1(圖5)。

    2.4 不同碳、氮源對(duì)猴頭菌胞外酶活性的影響

    2.4.1 不同碳、氮源對(duì)羧甲基纖維素酶活性的影響 羧甲基纖維素酶表征了纖維素酶的活性。纖維素酶是一種復(fù)合酶,是胞外酶的重要組成部分。試驗(yàn)結(jié)果表明,尿素處理的羧甲基纖維素酶活性最強(qiáng);酵母浸粉、蛋白胨、葡萄糖、果糖處理的羧甲基纖維素酶活性較強(qiáng),且處于同一水平;乳糖、苯丙氨酸、谷氨酰胺處理羧甲基纖維素酶活性次之;麥芽糖、酵母膏處理羧甲基纖維素酶活性較弱;淀粉和纖維素處理羧甲基纖維素酶活性最弱,且與其他處理差異顯著(圖6)。

    2.4.2 不同碳、氮源對(duì)半纖維素酶活性的影響 半纖維素酶是一種重要的復(fù)合酶,能將構(gòu)成植物細(xì)胞膜的多糖類(纖維素和果膠物質(zhì)除外)加水分解的各種酶的總稱。試驗(yàn)結(jié)果表明,谷氨酰胺和硝酸銨處理的半纖維素酶活性最強(qiáng);尿素和苯丙氨酸處理的半纖維素酶活性較強(qiáng);蛋白胨、酵母浸粉、乳糖和葡萄糖誘導(dǎo)半纖維素酶活性在同一水平;酵母膏、蔗糖、果糖、淀粉和纖維素處理半纖維素酶活性最弱(圖7)。

    2.4.3 不同碳、氮源對(duì)淀粉酶活性的影響 淀粉酶是指一類能催化分解淀粉(包括糖原、糊精等)糖苷鍵的酶的總稱。試驗(yàn)結(jié)果表明,谷氨酰胺和苯丙氨酸處理的淀粉酶活性最強(qiáng);硝酸銨處理的淀粉酶活性次之;葡萄糖、麥芽糖、酵母浸粉和蛋白胨處理的淀粉酶活性較強(qiáng);果糖、蔗糖、乳糖、酵母膏和尿素誘導(dǎo)淀粉酶活性在同一水平;淀粉和纖維素淀粉酶活性最弱,且與其他處理差異顯著(圖8)。

    3 討論

    本試驗(yàn)結(jié)果表明,猴頭菌菌絲單糖、雙糖、多糖均可以利用。其中以果糖、葡萄糖為碳源的效果較好,蔗糖為碳源的次之,所得到的結(jié)論與賈素巧的研究結(jié)果[10]相似。猴頭菌利用單糖效果好于雙糖,雙糖效果好于多糖,可能是因?yàn)樾》肿游镔|(zhì)可以直接被吸收利用,大分子物質(zhì)需要胞外酶分解后才可利用。同時(shí)本研究也發(fā)現(xiàn),在有機(jī)氮培養(yǎng)基中,猴頭菌菌絲生長(zhǎng)快,與肖光輝等結(jié)論[11]相同,可能是因?yàn)橛袡C(jī)氮源中含有豐富的蛋白質(zhì)、多肽和氨基酸,水解后提供了可被直接利用的氨基酸。當(dāng)使用無(wú)機(jī)氮為氮源時(shí),菌絲必須利用無(wú)機(jī)氮合成其需要的各種氨基酸,而某些氨基酸幾乎或完全不能生物合成,所以菌絲長(zhǎng)勢(shì)緩慢[12]。猴頭菌固體培養(yǎng)料中含營(yíng)養(yǎng)成分較為豐富,無(wú)法試驗(yàn)單獨(dú)某一種營(yíng)養(yǎng)對(duì)猴頭菌子實(shí)體品質(zhì)的影響。運(yùn)用液體培養(yǎng)法,在營(yíng)養(yǎng)液中培育出猴頭菌子實(shí)體[13],可以探究不同碳、氮源對(duì)猴頭菌子實(shí)體的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明,在可形成子實(shí)體的碳源處理中,可溶性糖含量和可溶性蛋白含量變化趨勢(shì)相同,都是蔗糖含量高于葡萄糖。而在可形成子實(shí)體的氮源處理中,可溶性糖含量、可溶性蛋白含量和還原糖含量變化差別較大,說(shuō)明氮源對(duì)子實(shí)體品質(zhì)的影響較大。

    胞外酶是細(xì)胞內(nèi)合成在細(xì)胞外起作用的一類酶[14],食用菌利用胞外酶分解培養(yǎng)料中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。木質(zhì)纖維素是大分子物質(zhì),被分解成小分子物質(zhì)后才能被食用菌吸收利用,食用菌主要通過(guò)分泌相關(guān)的木質(zhì)纖維素酶將木質(zhì)纖維素最終降解為還原糖[15],且已有研究指出纖維素酶活性最高值、最低值與子實(shí)體產(chǎn)量相關(guān)[16]。在本試驗(yàn)中猴頭菌菌絲在不同碳、氮源培養(yǎng)基中分泌的酶活性不同。其中,羧甲基纖維素酶在尿素處理中產(chǎn)生的活性最高;半纖維素酶在谷氨酰胺和硝酸銨2個(gè)處理中產(chǎn)生的活性較高;淀粉酶在苯丙氨酸和谷氨酰胺2個(gè)處理中產(chǎn)生的活性較高。羧甲基纖維素酶、半纖維素酶、淀粉酶的整體趨勢(shì)都是氮源處理誘導(dǎo)酶活性高于碳源處理,表明某些氮源可以提高菌絲胞外酶活性。

    將生長(zhǎng)指標(biāo)與胞外酶活性聚類分析,羧甲基纖維素酶活性與液體培養(yǎng)菌絲干質(zhì)量相關(guān)性較高,半纖維素酶活性和淀粉酶活性相關(guān)性較高(圖9)。菌絲日生長(zhǎng)速度對(duì)胞外酶活性影響較小。從供試猴頭菌生長(zhǎng)指標(biāo)來(lái)看,氮源酵母膏、酵母浸粉、蛋白胨和碳源蔗糖、果糖、葡萄糖、麥芽糖配合效果較好。另外供試碳源和氮源對(duì)菌絲干質(zhì)量積累與羧甲基纖維素酶活性影響趨勢(shì)相近,表明羧甲基纖維素酶可能在菌絲干重積累過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。供試的3種酶活性在不同碳、氮源情況下,可能均優(yōu)先供應(yīng)干物質(zhì)積累。

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