油菜菌核病抗性鑒定方法比較及抗病種質(zhì)資源的篩選

何烈干，宋來強，湯 潔，周銀生，馬輝剛

(1.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所，江西南昌330200;2.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，江西南昌330200;3.江西省弋陽縣植保植檢站，江西弋陽334400)

油菜菌核病是由核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)侵染引起的一種世界性真菌病害，位居油菜三大病害之首［1］。該病在我國各個油菜產(chǎn)區(qū)都有發(fā)生，在長江流域發(fā)生尤為嚴(yán)重，在江西省發(fā)病率一般在15%～35%之間，重病年份損失可達80%以上，種子含油量平均降低5%以上，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟損失［2－3］。目前防治菌核病的傳統(tǒng)措施是施用化學(xué)藥劑，但由此造成的環(huán)境污染問題越來越嚴(yán)重，且因長期大量使用化學(xué)藥劑，該病已對一些傳統(tǒng)藥劑(如多菌靈)產(chǎn)生了抗藥性。培育優(yōu)良的抗病品種是防治油菜菌核病既經(jīng)濟、有效又安全的措施［4－6］。因此在油菜雜交育種中對菌核病抗性鑒定和抗病品種的篩選顯得尤為重要，而鑒定方法的選用又是其關(guān)鍵環(huán)節(jié)［7］。目前，國內(nèi)外對油菜菌核病的抗性鑒定方法的研究較多［8－12］，而對這些方法優(yōu)缺點作系統(tǒng)比較并進行品種抗性鑒定與評價的研究鮮有報道。以往的研究報道中，如常用的牙簽法是以人為破壞植株組織結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的，所得研究結(jié)果較菌核病的自然侵染存在一定的差異，因此本研究以多種抗感品種為基礎(chǔ)采用幾種常用且有效的油菜菌核病抗病性鑒定方法進行系統(tǒng)比較，明確各種方法的優(yōu)缺點，從中篩選出一種準(zhǔn)確可靠有效的鑒定方法，為油菜菌核病抗性品種資源的有效篩選提供理論依據(jù)，并依據(jù)此法對25份油菜種質(zhì)材料進行菌核病抗性鑒定，為抗病育種提供抗源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

秦優(yōu)七號等25個油菜品種用于抗性鑒定方法的比較，25份育種材料用作抗源的篩選，以上種質(zhì)資源由江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所提供。

1.2 試驗設(shè)計

用于抗病性鑒定方法比較的材料播期為2015年10月12日，播種方式為種子直播，采用隨機區(qū)組設(shè)計，每小區(qū)20 m2，3個重復(fù)。用于抗源篩選的材料的播期為2015年10月18日，播種方式為種子直播，采用隨機區(qū)組排列，小區(qū)面積15 m2，試驗設(shè)3個重復(fù)，按生產(chǎn)常規(guī)管理。

1.3 供試菌株

2015年4月底在江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院良種場油菜地采集菌核，經(jīng)表面消毒后，接種于PDA平板，在25℃條件下培養(yǎng)4～6 d至長出菌絲進行純化鑒定，最后轉(zhuǎn)至PDA斜面置于4℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 抗性鑒定方法

1.4.1 花期瓊脂塊葉腋接種法［13］將備用的供試核盤菌菌絲取出，經(jīng)PDA培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)后，置于25℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d，待菌絲充分生長后用打孔器沿菌落邊緣打孔成6 mm的菌絲圓片，然后將1個圓片和浸濕的棉花包在一起，用透明膠布綁在盛花期油菜的相同葉位的葉腋處，注意密封保濕，并每天定期噴水，7 d后量取病斑長度，14 d后再次量取病斑長度，病情分級的評價采用0～9級標(biāo)準(zhǔn):0級，健康植株;1級，病斑長度僅出現(xiàn)在接種點處，無擴展;2級，表面侵染面積達莖稈面積的25%;3級，表面侵染面積達莖稈面積的50%;4級，表面侵染面積達莖稈面積的75%;5級，病斑傷害深度達莖稈直徑的25%;6級，病斑傷害深度達莖稈直徑的50%;7級，病斑傷害深度達莖稈直徑的75%;8級，整個植株嚴(yán)重受害，出現(xiàn)大面積的白色病斑;9級，植株死亡。

1.4.2 草酸浸根法 待供試品種長至5葉期時，選取大小相同的連根健康幼苗，用清水沖洗干凈，放入盛有150 mL(濃度15 mmol/L)草酸溶液的燒杯中。試驗設(shè)3次重復(fù)，每次25株幼苗和對照品種(低感品種)隨機排列置于22℃空調(diào)房內(nèi)。用薄膜罩住幼苗使其保濕，每隔12 h向薄膜噴1次水，每12 h補加1次草酸溶液至150 mL，以保證致病濃度。當(dāng)對照品種開始發(fā)病時作第1次調(diào)查，對照品種大部分植株半數(shù)葉片萎蔫時作第2次調(diào)查，每次均分級記載。

病情分級標(biāo)準(zhǔn)按劉勝毅等的5級分級法［14］:0級，無病狀;1級，葉尖病變;2級，全株半數(shù)以下葉片的葉身病變;3級，半數(shù)及其以上葉片的葉身病變，或半數(shù)及其以下葉片的葉柄病變;4級，半數(shù)以上葉片的葉柄病變;5級，全株葉柄病變。根據(jù)病害級別求病情指數(shù)DI=［∑(ng)/(5N)］×100。式中:g為病害級別，n為每級別中植株數(shù)，N為植株總數(shù)，5為最高病級。

1.4.3 營養(yǎng)生長期瓊脂塊離體葉片法 當(dāng)供試品種長至6～7葉期時，每個品種選大小相同的植株，每株選取大小和葉位相同的健康葉片1張備用。每個品種接種5張葉子，每張葉片2個接種點，重復(fù)3次。準(zhǔn)備若干個塑料飯盒，每個飯盒底部鋪2張濾紙，在飯盒中加入20 mL蒸餾水，將濾紙浸透，把備用的葉片分別平鋪于飯盒中。將備用的菌種菌絲取出，接種于PDA平板上，置于25℃下擴大培養(yǎng)3 d后，用直徑6 mm打孔器在菌落邊緣打孔成菌絲圓片。挑取菌絲圓片接種到油菜葉片上，2個接種點在葉片中部沿葉脈呈軸對稱，蓋上蓋子，水平放置在25℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)。每隔24 h測量1次病斑直徑，共測4次，按5級標(biāo)準(zhǔn)［2］調(diào)查發(fā)病情況:0級，無病;1級，病斑面積占全葉面積的10%以下;2級，病斑面積占全葉面積的11% ～30%;3級，病斑面積占全葉面積的31% ～50%;5級，病斑面積占全葉面積的51%以上。

1.4.4 盛花期牙簽莖稈接種法 參照劉勇等的火柴棍莖稈接種法［15］，將牙簽置于盛有PD培養(yǎng)液的燒瓶中，浸泡24 h后滅菌備用。將供試菌株接種到PDA培養(yǎng)基中，把備用的牙簽呈放射狀均勻擺放在圓片周圍，每個培養(yǎng)皿10根。當(dāng)油菜處于盛花期時，選用健康的植株，用直徑為3 mm的消毒鐵釘在離地面30 cm左右處打孔，然后把接種體插入孔中，每個品種接種20株，試驗設(shè)3次重復(fù)，接種后觀察病斑沿莖稈方向的擴展情況，每7 d量取1次病斑長度，共調(diào)查2次。

1.4.5 初花期活體葉片菌絲塊接種法 待油菜苗長至初花期時，將備用的菌株菌絲轉(zhuǎn)接至PDA培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5 d后，用打孔器沿菌落邊緣打孔成6 mm的菌絲圓片，帶菌絲的一面貼在油菜植株的相同部位較嫩葉片上，用透明膠封住圓片以保濕。接種后24 h保證溫度在25℃左右并噴水，5 d后進行病害調(diào)查［16］，發(fā)病情況分級同“1.4.3”節(jié)的方法。

1.4.6 大田接種鑒定法 供試的25個油菜品種播種時1 m2土壤施2粒菌核，試驗設(shè)3個重復(fù)。參考李麗麗等的方法［17］，于成熟期分級調(diào)查病害。

1.5 統(tǒng)計分析方法

參考周必文等的方法［18］，以對照發(fā)病株率為選擇壓力標(biāo)準(zhǔn)，田間鑒定為 ＞10%、＜100%;接種鑒定為 ＞40%、＜100%。符合選擇壓力標(biāo)準(zhǔn)為有效鑒定，以有效鑒定試驗結(jié)果統(tǒng)計抗病率，抗病性以抗病率(RR)表示:RR=(CK－M)/CK。式中:CK為對照病害值，M為鑒定目標(biāo)病害值。

花期瓊脂塊葉腋接種法、草酸浸根法和大田接種鑒定法這3種方法中，油菜品種的抗病性差異用病情指數(shù)表示，營養(yǎng)生長期瓊脂塊離體葉片法和初花期活體葉片菌絲塊接種法用病斑直徑表示，而盛花期牙簽莖稈接種法用莖稈上的條形病斑長度表示油菜品種抗病性高低?；ㄆ诃傊瑝K葉腋接種法、草酸浸根法和盛花期牙簽莖稈接種法這3種方法的結(jié)果是第2次調(diào)查的平均值，營養(yǎng)生長期瓊脂塊離體葉片法的結(jié)果是96 h后的調(diào)查的平均值。在相同方法下進行品種間的差異顯著性檢驗。

1.6 油菜抗源的篩選

采用初花期瓊脂塊葉片接種法，對25份育種材料進行菌核病抗性鑒定與篩選，試驗設(shè)3次重復(fù)，每份材料鑒定20株。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗病性鑒定方法的比較

2.1.1 不同方法的鑒定結(jié)果 由表1可知，25個品種在6種鑒定方法中的抗感性都存在不同程度的差異，以最為接近自然條件下發(fā)病程度的大田接種法為基準(zhǔn)，草酸浸根法和營養(yǎng)生長期瓊脂塊離體葉片法的結(jié)果之間差異相對不太顯著，而花期瓊脂塊葉腋接種法、初花期活體葉片菌絲塊接種法和盛花期牙簽莖稈接種法均表現(xiàn)出顯著性差異，即苗期品種間的抗感性差異較小，成株期品種間的差異較為顯著。

表1 不同方法對未知抗、感品種抗性的鑒定結(jié)果

油菜菌核病在苗期和成株期均可發(fā)生，成株期發(fā)生和危害都較苗期嚴(yán)重，因而成株期抗性水平是品種抗性評價的主要指標(biāo)。在苗期瓊脂塊離體葉片法中，中雙9號、華湘油12號和油研50表現(xiàn)為較高的感病性，而在花期瓊脂塊葉腋接種法、初花期活體葉片菌絲塊接種法和盛花期牙簽莖稈接種法中表現(xiàn)較強的抗性，南油68和華油雜13號在苗期表現(xiàn)為抗病性，而在成株期卻表現(xiàn)為感病性，苗期鑒定結(jié)果與成株期不一致，苗期鑒定方法與成株期鑒定方法存在著差異。

以最接近田間發(fā)病條件的大田接種法為對照，在抗感性鑒定結(jié)果較為接近真實田間發(fā)病狀況的花期瓊脂塊葉腋接種法、初花期活體葉片菌絲塊接種法和盛花期牙簽莖稈接種法等3種方法中，綜合對比發(fā)現(xiàn)，以初花期活體葉片菌絲塊接種法的抗感性鑒定結(jié)果與大田接種法最接近，本試驗得出的幾種方法之間差異顯著性結(jié)果與冉毅等的結(jié)論［27］較為一致。另外，試驗所選品種陽光2009在花期牙簽莖稈接種法中表現(xiàn)出高感病性，而在其余5種方法中卻表現(xiàn)為較高的抗病性，這可能是由于陽光2009抗擴展而不抗侵染，牙簽接種人為破壞了表皮組織使得病菌得以侵入。

2.1.2 不同鑒定方法的相關(guān)性 將表1的結(jié)果轉(zhuǎn)化成病情指數(shù)，由病情指數(shù)分析得到不同鑒定方法之間的相關(guān)系數(shù)。結(jié)果(表2)顯示，不同的鑒定方法之間既有正相關(guān)，也有負(fù)相關(guān)。初花期活體葉片菌絲塊接種法、花期瓊脂塊葉腋接種法和盛花期牙簽莖稈接種法與大田接種法之間的相關(guān)系數(shù)分別為 0.954 0、0.941 6、0.860 4，均達到了極顯著水平，是可靠的人工接種鑒定法。營養(yǎng)生長期瓊脂塊離體葉片法與大田接種法之間的相關(guān)系數(shù)是－0.078 5，草酸浸根法與大田接種法之間的相關(guān)系數(shù)為0.229 2，這2種方法與大田接種法存在著較大的出入，可知不是可靠的人工接種方法。因此從上面5種人工接種鑒定方法的試驗結(jié)果來看，油菜菌核病不同鑒定方法之間接種實際效果不同，在進行油菜菌核病的抗性鑒定試驗中，應(yīng)當(dāng)選擇一種最接近菌核病田間真實發(fā)病情況的接種方法。

2.2 抗源篩選

根據(jù)上述研究結(jié)果，選用初花期活體葉片菌絲塊接種法對25份材料進行鑒定。以贛油雜7號為對照，采用接種后5 d調(diào)查到的數(shù)據(jù)進行材料間抗病性差異比較。結(jié)果(表3)顯示，供試材料間抗、感差異顯著，3M017、3M005、3M013、3M021等對菌核病的抗性較對照差，其差異達到顯著水平;3M011、3M022 等與對照抗性相當(dāng);3M009、3M020、3M012等抗性高于對照，其差異達到顯著水平。根據(jù)抗性鑒定結(jié)果可知，3M009和3M020的抗病率在0.3以上，顯著高于對照，是很好的高抗材料，3M012、3M004、3M018、3M024 和3M007的抗病率在0.05～0.20，顯著高于對照，也是較好的抗性材料。

表2 不同鑒定方法之間的相關(guān)系數(shù)

表3 25個油菜材料抗性鑒定結(jié)果

3 討論與結(jié)論

本試驗采用了6種接種方法鑒定了25個品種對油菜菌核病的抗性，結(jié)果表明，不同的抗性鑒定方法之間效果不同。與已有研究報道不同的是，本試驗采用了多個抗感品種作為鑒定對象，避免了因品種數(shù)量少而使結(jié)果存在著一定的偶然性誤差，且所選品種的抗性未知，從而更加全面準(zhǔn)確地比較了各種方法之間的相關(guān)性和優(yōu)缺點。

草酸浸根法在油菜苗期抗菌核病材料的篩選中應(yīng)用較為廣泛，在育種材料早期鑒定中起到了較好的作用，省力省時，研究報道較多［19－20］。但在本研究方法中，其與大田接種法之間的相關(guān)性不顯著，其原因可能是由于油菜成株期后抗感性發(fā)生了改變。營養(yǎng)生長期瓊脂塊離體葉片法是利用離體葉片所進行的鑒定方法，該法不影響作物生長發(fā)育，可以保護珍貴的育種材料，具有周期短、成本低、見效快的優(yōu)點，目前應(yīng)用較為廣泛，在本試驗中該法與其他幾種方法之間相關(guān)性不顯著，因為其在離體條件下進行，不能反映活體的狀況。上述2種方法反映出苗期抗性與成株期抗性存在差異，其是否適合油菜抗性鑒定還有待于進一步驗證。

本試驗的3種成株期鑒定方法與大田接種鑒定呈顯著正相關(guān)，是可靠的鑒定方法。這3種方法中，初花期活體葉片菌絲塊接種法與大田接種法相關(guān)性最高，是最可靠的鑒定方法，這與一些研究報道有差異，花期瓊脂塊葉腋接種法次之，盛花期牙簽莖稈接種法稍差，雖然其病斑長度差異較為顯著，但因為其破壞了植物的表皮組織，極少數(shù)品種存在著抗侵染不抗擴展現(xiàn)象，從而導(dǎo)致結(jié)果存在著一定的誤差。現(xiàn)有相關(guān)研究表明，作物上抗性基因表達存在時空差異，苗期鑒定結(jié)果不一定能反映成株期或花期的結(jié)果。因此對油菜菌核病的接種鑒定，應(yīng)以成株期的鑒定尤以初花期活體葉片菌絲塊接種法為可靠鑒定法。

對油菜的接種鑒定法除了本研究提到的6種外，還有草酸浸葉法、菌絲培養(yǎng)液浸根法、子囊孢子接種法、氣候室盆栽接種鑒定和無菌法等。子囊孢子接種法可以在一定程度上模擬自然侵染過程:子囊盤彈射出子囊孢子附著在花瓣上，子囊孢子通過花瓣去侵染葉片和莖稈，但是在操作過程中，子囊孢子的收集較麻煩，接種數(shù)量不好控制。草酸浸葉法與草酸浸根法相似，都與成株期的抗感性存在著一定的差異。

抗源是從事抗病育種的基礎(chǔ)，本試驗采用初花期活體葉片菌絲塊接種法對25份材料進行了鑒定，篩選到了7份抗性較好的材料，其中有2份材料的抗病率在0.3以上，是非常好的抗源材料。