高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定釀酒原料中10種真菌毒素

周韓玲，廖勤儉，宋廷富，安明哲，李楊華，王 芳，郭 艷，王小琴，羅 珠

(宜賓五糧液集團(tuán)有限公司技術(shù)中心，四川宜賓644007)

真菌毒素（Mycotoxins）是某些真菌產(chǎn)生的二級代謝產(chǎn)物，目前已知的真菌毒素有300多種，在糧食谷物中較受關(guān)注的真菌毒素主要有黃曲霉毒素（Aflatoxins）、赭曲霉毒素A（Ochratoxin A）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）、玉米赤霉烯酮（Zearalmone，ZEN）、HT-2毒素（HT-2）、T-2毒素（T-2）、展青霉素（patulin，PAT）、雜色曲霉毒素（Sterigmatocystin，ST）等，其中，糧食中污染的黃曲霉毒素主要有黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）、黃曲霉毒素B2（Aflatoxin B2，AFB2）、黃曲霉毒素G1（Aflatoxin G1，AFG1）和黃曲霉毒素G2（Aflatoxin G2，AFG2）4種[1]。真菌毒素被歸類為比合成污染物、食品添加劑或農(nóng)藥殘留更重要的食源性風(fēng)險因子，其中，黃曲霉毒素B1被公認(rèn)為是目前具有強(qiáng)致癌力的天然物質(zhì)之一[2]。真菌毒素廣泛存在于以糧谷為原料的食品和飼料中，我國針對食品中的真菌毒素制訂了限量標(biāo)準(zhǔn)，對食品中黃曲霉毒素B1的最高允許量為：玉米、花生及其制品中不得超過20 μg/kg；大米及食用油類不得超過10 μg/kg；其他糧食、豆類及發(fā)酵食品中不得超過5 μg/kg；小麥、面粉、玉米及玉米粉中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇不得超過1000 μg/kg；小麥、玉米中玉米赤霉烯酮的限量為60 μg/kg[3]。

真菌毒素的檢測方法有酶聯(lián)免疫法（ELISA）、薄層層析色譜法（TIC）、液相色譜法（HPLC）、液相與質(zhì)譜聯(lián)用檢測法（LC-MS）等。ELISA法具有前處理簡單、特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點，但是該方法存在一定的假陽性；TIC法無需昂貴設(shè)備，成本低，但是操作復(fù)雜，精確度低；HPLC法穩(wěn)定性好、靈敏度高，但是該法只依靠保留時間定性，存在一定的假陽性，且該法一次只能檢測同一類毒素，無法做到多種真菌毒素的同時檢測。LC-MS法依靠目標(biāo)化合物的保留時間和分子結(jié)構(gòu)信息定性，準(zhǔn)確性好，具有靈敏度高、雜質(zhì)影響小的特點，可同時分析多種真菌毒素[4-5]。本試驗采用黃曲霉毒素免疫親和柱和多功能柱對樣品進(jìn)行凈化，利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，其中，AFB1、AFB2、AFG1、AFG2采用外標(biāo)法定量，HT-2、T-2、ST、DON、ZEN、PAT這6種毒素使用內(nèi)標(biāo)法定量，方法穩(wěn)定性好，靈敏度高，適用于釀酒原料中多種真菌毒素的分析。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

原料樣品：小麥、大米、玉米、糯米、高粱，五糧液股份有限公司提供。

儀器設(shè)備：5500三重四極桿液相質(zhì)譜儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；5810R冷凍離心機(jī)（德國Eppendof公司）；百分之一天平（梅特勒-托利多公司）；十萬分之一天平（梅特勒-托利多公司）；振蕩器（德國IKA公司）；固相萃取儀（上海安譜有限公司）；旋風(fēng)磨（福斯公司）；超純水制備儀（美國Millipore公司）。

試劑耗材：甲醇（LC-MS級，美國Merck公司）；甲酸（美國fisher公司）；真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品：AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、HT-2、T-2、ST、DON、ZEN、PAT（99%，百靈威試劑公司）；真菌毒素同位素內(nèi)標(biāo)：13C22-HT-2、13C24-T-2、13C18-ST、13C7-PAT、13C15-DON、13C18-ZEN（25.1 mg/L，Romer公司），真菌毒素免疫親和柱（Romer公司）；Mycosep 226多功能凈化柱（Romer公司）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：分別準(zhǔn)確稱取AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、HT-2、T-2、ST、DON、ZEN、PAT各0.00010 g，分別以甲醇定容至10 mL，配成濃度為100 mg/L的儲備液；稱取0.00010 g PAT，以0.2%甲酸水溶液定容至10 mL，配成濃度為100 mg/L的儲備液，分別吸取一定量的HT-2、T-2、ST、DON、ZEN、PAT標(biāo)準(zhǔn)儲備液，以甲醇定容至5 mL，配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（1），混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（1）中HT-2、T-2、ST、DON、ZEN、PAT濃度分別為1 mg/L、1 mg/L、40 μg/L、40 μg/L、10 mg/L、2 mg/L。分別吸取一定量的AFB1、AFB2、AFG1、AFG2標(biāo)準(zhǔn)儲備液，以甲醇定容至5 mL，配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（2），混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（2）中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2濃度均為200 μg/L。

真菌毒素同位素內(nèi)標(biāo)的配制：分別吸取一定量的13C22-HT-2、13C24-T-2、13C18-ST、13C18-ZEN、13C7-PAT、13C15-DON標(biāo)準(zhǔn)溶液，各以甲醇定容至5 mL，制備內(nèi)標(biāo)儲備液，使得各內(nèi)標(biāo)濃度分別為1 mg/L、1 mg/L、100 μg/L、100 μg/L、1 mg/L、1 mg/L。

以20%甲醇稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（1）和混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（2），配成一系列的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個標(biāo)準(zhǔn)溶液中含有13C22-HT-2、13C24-T-2、13C18-ST、13C18-ZEN、13C7-PAT、13C15-DON濃度分別為10 μg/L、10 μg/L、0.5 μg/L、0.5 μg/L、20 μg/L、100 μg/L。

1.3 液相色譜、質(zhì)譜條件

液相色譜條件：色譜柱：C18柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），相：A：5 mmol/L甲酸銨溶液，B：甲醇。洗脫梯度：0 min，80%A；5 min，50%A；7～10 min，2%A；11～15 min，80%A。流速：0.2 mL/min。柱溫：30 ℃。進(jìn)樣體積：5 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI）；檢測方式：多離子反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；毛細(xì)管電壓：5500 V（ESI+），4500 V（ESI-）；氣簾氣：35 psi；碰撞氣：8 psi；離子源溫度：550 ℃；加熱氣1：55 psi；加熱氣2：55 psi。其他質(zhì)譜采集參數(shù)見表1。

1.4 樣品前處理

樣品前處理（1）：稱取粉粹后的樣品5.00 g，加入一定量的6種真菌毒素同位素內(nèi)標(biāo)，加入84%的乙腈20 mL，振蕩1 h后8000 r/min離心10 min，取上清液8 mL于Mycosep 226多功能柱的套管中，緩慢將柱芯推入試管底部，取4 mL套管中的凈化液，50℃下N2吹至干，以20%甲醇定容至1 mL，渦旋混勻，過0.22 μm濾膜，進(jìn)LC-MS/MS分析6種毒素含量[6]。

樣品前處理（2）：稱取粉粹后的樣品5.00 g，加入84%的乙腈20 mL，振蕩1 h后以8000 r/min離心10 min，取上清液4 mL，加入PBS緩沖液（pH7.4，含1%tritonX 100）46 mL，以約2 mL/min的速度上黃曲霉毒素免疫親和柱，待樣液滴完后，以2×10 mL超純水淋洗免疫親和柱，抽干，以2×1 mL甲醇洗脫，抽干，收集全部洗脫液，50℃下N2吹至干，以20%甲醇定容至1 mL，渦旋混勻，過0.22 μm濾膜，進(jìn)LC-MS/MS分析4種黃曲霉毒素含量[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動相的選擇

本實驗考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%甲酸水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-5 mmoL/L甲酸銨、甲醇-5 mmoL/L甲酸銨作為流動相的結(jié)果，實驗表明，以甲醇作為流動相時，質(zhì)譜信號強(qiáng)于以乙腈作為流動相時的質(zhì)譜信號，以甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、甲醇-5 mmoL/L甲酸銨作為流動相時，標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜信號強(qiáng)度相差不大，但是，以甲醇-5 mmoL/L甲酸銨作為流動相時，樣品中目標(biāo)化合物信號明顯強(qiáng)于以甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水作為流動相時的信號。因此，最終選擇甲醇-5 mmoL/L甲酸銨作為本實驗的流動相。

2.2 質(zhì)譜條件的選擇

本實驗對10種真菌毒素及6種同位素內(nèi)標(biāo)的離子化方式、去簇電壓、碰撞電壓等進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果見表1。

表1 真菌毒素質(zhì)譜條件

2.3 前處理方法及內(nèi)標(biāo)的選擇

本實驗采用多功能凈化柱對樣品進(jìn)行凈化處理，其原理是提取液通過不同類型的吸附劑裝填而成的柱體，吸附劑吸附雜質(zhì)而不吸附目標(biāo)物，從而達(dá)到樣品凈化的目的，在本實驗中，采用Mycosep 226多功能凈化柱對高粱、玉米、小麥、大米、糯米樣品進(jìn)行凈化，不用內(nèi)標(biāo)校正時，10種真菌毒素回收率偏低，均低于65%，其原因可能是吸附劑對真菌毒素有一定的吸附作用，也可能是多功能柱除雜不完全，基質(zhì)中雜質(zhì)對測定有一定的干擾，因此，本實驗采用6種同位素13C22-HT-2、13C24-T-2、13C18-ST、13C7-PAT、13C15-DON、13C18-ZEN分別作為HT-2、T-2、ST、PAT、DON 、ZEN的內(nèi)標(biāo)；而市場上所售黃曲霉毒素同位素標(biāo)品濃度低，價格昂貴，不適用于企業(yè)大量樣品的監(jiān)測，因此，在本實驗中，4種黃曲霉毒素采用外標(biāo)法進(jìn)行定量，所采用的預(yù)處理柱為黃曲霉毒素免疫親和柱，使用1支免疫親和柱即可處理1個樣品中的4種毒素，結(jié)果穩(wěn)定，方法可靠。

表2 10種真菌毒素的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.4 方法的線性范圍、檢出限與定量限

HT-2、T-2、ST、ZEN、DON、PAT采用內(nèi)標(biāo)法定量，以待測化合物和各自的峰面積為縱坐標(biāo)，以待測化合物的濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析，AFB1、AFB2、AFG1、AFG2采用外標(biāo)法定量，以待測化合物峰面積為縱坐標(biāo)，以待測化合物的濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析，得到線性方程和相關(guān)系數(shù)，分別取空白高粱粉和大米粉作為基質(zhì)，添加不同量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（1），按1.4中樣品前處理（1）處理，添加不同量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（2），按1.4中樣品前處理（2）處理，分析測定后，按照S/N=3計算各化合物的檢出限，按S/N=10計算各化合物的定量限，結(jié)果見表2，10種真菌毒素及6種同位素內(nèi)標(biāo)MRM色譜圖見圖1至圖18。

圖1 正模式下6種毒素和3種同位素內(nèi)標(biāo)MRM色譜圖

圖2 AFB1 MRM色譜圖

圖3 AFB2 MRM色譜圖

圖4 AFG1 MRM色譜圖

從表2可看出，10種真菌毒素在各自的線性范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R）均不低于0.998，各種真菌毒素的檢出限及定量限低，能滿足日常測樣的要求。

2.5 加標(biāo)回收率及精密度實驗

圖5 AFG2 MRM色譜圖

圖6 ST MRM色譜圖

圖7 13C18-ST MRM色譜圖

圖8 HT-2 MRM色譜圖

圖9 13C22-HT-2 MRM色譜圖

圖10 T-2 MRM色譜圖

圖11 13C24-T-2 MRM色譜圖

圖12 負(fù)模式下3種毒素和3種同位素內(nèi)標(biāo)MRM色譜圖

圖13 PAT MRM色譜圖

圖14 13C7-PAT MRM色譜圖

圖15 DON MRM色譜圖

圖16 13C15-DON MRM色譜圖

圖17 ZEN MRM色譜圖

圖18 13C18-ZEN MRM色譜圖

取空白高粱、大米樣品，分別添加不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（1）和混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（2），分別按照.4中前處理方法（1）和前處理方法（2）處理，進(jìn)行加標(biāo)實驗，每個加標(biāo)水平平行測定5次，計算各種真菌毒素的回收率和精密度，結(jié)果見表3，采用內(nèi)標(biāo)法定量的6種真菌毒素在3個水平下平均加標(biāo)回收率為77.96%～116.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.88～4.83。采用外標(biāo)法定量的4種黃曲霉毒素在3個水平下平均加標(biāo)回收率為61%～102.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.11%～8.61%，其中，AFB2前處理損失最大，加標(biāo)回收率相對較低，為61%～76%，AFG2加標(biāo)回收率最好，為85.0%～102.7%。

表3 10種真菌毒素的加標(biāo)回收率和精密度(n=5)

2.6 實際樣品的測定

按上述建立的檢測方法對五糧液公司釀酒所使用的高粱、玉米、小麥、大米、糯米中真菌毒素含量進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明，5種釀酒原料中均未檢出上述10種真菌毒素。

3 結(jié)論

建立了基于高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的釀酒原料中10種真菌毒素的檢測方法，使用黃曲霉毒素免疫親和柱和Mycosep 226多功能柱可實現(xiàn)高粱、玉米、小麥、大米、糯米中10種毒素的凈化。實驗表明，該方法靈敏度高，穩(wěn)定性好，適用于釀酒原料中10種真菌毒素的檢測。