黃孢原毛平革菌預處理對酒糟酶解效果的影響

裴芳霞

（黔南州糧油質(zhì)量檢測中心，貴州都勻558000）

隨著化石能源的日益枯竭，生物能源的開發(fā)不僅有助于緩解日益嚴重的能源危機，還能減輕對地球溫室效應和霧霾天氣影響。木質(zhì)纖維生物質(zhì)各組分結構復雜，彼此關聯(lián)。纖維素和半纖維素鏈內(nèi)和鏈間主要通過氫鍵連接，木質(zhì)素內(nèi)部除了有強大的氫鍵連接外，還與半纖維素形成穩(wěn)定的木質(zhì)素-碳水化合物復合體。三者相互交織的結構決定了任何一類成分的降解必然受到其他成分的制約，如木質(zhì)素對纖維素和半纖維素酶解過程的空間位阻作用，很難使水解酶直接作用于底物，導致酶解效率和糖得率較低[1]。因此，需要通過預處理技術破壞木質(zhì)纖維素的致密結構，改變木質(zhì)素與半纖維素周圍的基質(zhì)結構，提高酶與底物的接觸面積，使其在酶作用下降解為可發(fā)酵糖，這也是燃料乙醇轉(zhuǎn)化的關鍵步驟和技術瓶頸[2]。

近年來在關于白腐真菌預處理的研究報告中，部分研究者認為，白腐菌預處理后酶解率提高的主要原因可能是預處理過程增加原料的多孔性，降低其結晶度，導致部分木質(zhì)素被去除，木質(zhì)纖維原料網(wǎng)絡結構遭到破壞，增加酶與底物的可及性，使碳水化合物轉(zhuǎn)化為還原糖的轉(zhuǎn)化率提高[3-5]。Sun等[6]研究T.hirsutayj9預處理對玉米秸稈酶解效果的影響時發(fā)現(xiàn)，T.hirsutayj9預處理42 d后秸稈中木質(zhì)素的降解率達到71.49%，最主要的木質(zhì)素降解和水解酶漆酶和木聚糖酶的濾紙酶活性隨著處理時間的增加逐漸增加。

本實驗主要對白腐菌生長曲線、白腐菌固態(tài)發(fā)酵時間對酒糟組分及酶解效果的影響進行研究，以及白腐菌結合超聲波預處理的酒糟進行纖維素酶和木聚糖酶的水解，評價白腐菌預處理酒糟對纖維素酶和木聚糖酶水解的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒糟，甘肅金徽酒股份有限公司提供，自然晾干后粉碎過40目篩備用。主要組分成分為：纖維素27.42%，木質(zhì)素9.7%，半纖維素21.86%，蛋白質(zhì)12.45%，脂肪3.02%，灰分9.05%（以干基計）。

黃孢原毛平革菌（P.chaysosporium），購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)。

纖維素酶(濾紙酶活力為10萬U/g)和木聚糖酶(酶活力為5萬U/g)，寧夏和氏璧生物技術有限公司；間苯三酚，上海藍季科技發(fā)展有限公司；D-木糖，天津市光復精細化工研究所；其余試劑為分析純。

1.2 主要儀器

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；GZX-9240 MBE數(shù)顯鼓風干燥箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；Cary50紫外可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；恒溫振蕩培養(yǎng)箱，上海精密科學儀器有限公司；TG16-WS高速臺式離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；SB-JC-IB超凈工作臺，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；SHZ-82恒溫培養(yǎng)箱，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種保藏

將P.chaysosporium接種于PDA培養(yǎng)基上，于恒溫培養(yǎng)箱30℃培養(yǎng)，待白色的孢子鋪滿平板時，將平板轉(zhuǎn)移至4℃冰箱中保存?zhèn)溆茫吭陆臃N1次。

1.3.2 菌種培養(yǎng)

1.3.2.1 培養(yǎng)基的制備[7]

固體培養(yǎng)基（即PDA培養(yǎng)基）（g/L）：馬鈴薯提取液1.0 L、葡萄糖20.0，KH2PO43.0，MgSO4·7H2O 1.5，酵母膏0.1，瓊脂15.0，pH6.0。

液體基礎培養(yǎng)基（g/L）：KH2PO420.0，MgSO4·7H2O 5，CaCl21。

微量元素混合液（g/L）：氨基乙酸 1.5，MgSO4·7H2O 3，MnSO4·7H2O 0.5，NaCl 1.0，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1，CoCl2·6H2O 0.1，ZnSO4·7H2O 0.1，CuSO4·5H2O 0.1，KAl(SO4)2·12H2O 10 mg/L，H3BO410 mg/L，Na2MoO4·2H2O 10 mg/L，pH 6.5。

液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖10.0，酒石酸銨2.0，維生素B 11.2，400 mμ藜蘆醇1 mL，0.2 M醋酸鈉緩沖液（pH4.5）100 mL，液體基礎培養(yǎng)基100 mL，微量元素混合液50 mL。

1.3.2.2 菌懸浮液的制備

在無菌條件下，用接種環(huán)將PDA平板培基上的菌膜刮到無菌水中，30℃振蕩培養(yǎng)2 h后，用脫脂棉過濾，得到孢子懸浮液，用血球計數(shù)板測定菌懸液中的菌落單位數(shù)，測定菌懸液濃度在5×105cfu左右。

1.3.3 生物量的測定（以菌體干重計）

1.3.3.1 制備具有酶活性的菌液

將配制好的液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基分裝到20個100 mL的錐形瓶中，各裝50 mL，用透氣膜封口，在121℃、101 kPa下滅菌20 min，然后用移液槍移取2 mL菌懸液于其中的18個錐形瓶中，另外兩個作為對照組，將接種菌液的錐形瓶放置在30℃振蕩培養(yǎng)箱中（150 r/min)進行搖床培養(yǎng)，每隔12 h測定1次生物量。

1.3.3.2 生物量的測定

將液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的菌絲體用真空泵抽濾，抽濾前濾紙片烘干后的質(zhì)量計為m1，菌體和濾紙恒重后的質(zhì)量計為m2，則菌體干重為：m=m2-m1。

1.3.3.3 制作生長曲線

生物量增長最快的點為菌體對數(shù)期生長點，選該時間點為最佳產(chǎn)酶期。

1.3.4P.chaysosporium處理

準確稱取10 g酒糟于250 mL錐形瓶中，按1∶2.5(m/v)的比例加入液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基，用封口膜封口后，121℃高溫滅菌20 min，制成固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。接種菌懸液，保持接種量為30%(g∶mL)，封口后，將錐形瓶移入30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)時間分別為2 d、4 d、6 d、8 d、10 d、12 d，所有樣品均設3個平行實驗。發(fā)酵結束后，將錐形瓶放入105℃干燥箱中烘干至恒重，粉碎后用自封袋保存待測。

1.3.5 酶解處理

準確稱取2.0 g預處理殘渣，纖維素酶和木聚糖酶添加量為5000 U/g和4000 U/g進行酶解，酶解液用于測定還原糖和木糖濃度。

2 結果與分析

2.1 黃孢原毛平革菌接種菌齡的確定（圖1）

由圖1可知，在P.chaysosporium接種初期處于休眠狀態(tài)，隨著培養(yǎng)時間的延長，菌絲體重量開始緩慢增加，但當培養(yǎng)時間達到120 h時，隨著培養(yǎng)時間的延長其干重增長迅速，且在132 h時增長最快，說明菌體進入對數(shù)生長期，在該階段菌體生命力旺盛，是最佳接種期，當培養(yǎng)時間到156 h后，菌絲體干重達到最大，并在156～192 h內(nèi)基本保持不變，即產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物，進入產(chǎn)酶階段。當培養(yǎng)時間超過192 h時，菌絲體干重急速下降，說明菌體開始衰亡。菌種活性直接關系到發(fā)酵液中酶活的高低。為了提高酶解效果，接種時間應選在菌體對數(shù)期，因此該菌體的接種種齡為120 h[8]。

2.2 P.chaysosporium預處理時間對酶解效果的影響（圖2）

圖2 P.chaysosporium預處理對酶解效果的影響

由圖2可看出，P.chaysosporium預處理時間對預處理效果的影響意義重大。固態(tài)發(fā)酵時間在0～8 d范圍內(nèi)，隨著預處理時間的延長，還原糖和木糖得率呈逐漸增加趨勢，但是相對木糖得率而言還原糖得率增加趨勢明顯。當處理時間為8 d時，預處理樣品酶解液中還原糖和木糖得率達到最大值，分別為60.55%、21.33%。繼續(xù)延長預處理時間，還原糖和木糖得率逐漸下降?？赡艿脑蚴?，過長的預處理時間導致木質(zhì)素被降解，致使更多的纖維素暴露出來利于與酶結合，提高酒糟中纖維素和半纖維素與酶的可及性，從而提高酶水解得率[9]。

2.3 P.chaysosporium預處理對酒糟組分的影響

由表1可知，隨著P.chaysosporium預處理時間的延長，綜纖維素保留率和木質(zhì)素降解率均呈先增加后減小的趨勢，且在培養(yǎng)時間為8 d時，綜纖維素保留率和木質(zhì)素的降解率最好，分別為76.85%和26.44%。同時造成綜纖維素部分損失。謝菊蘭[10]在用白腐真菌降解稻草木質(zhì)纖維素的研究中表明，稻草接種菌F1和F2后木質(zhì)素的降解率可達39.32%和34.29%。黃慧等[11]研究P.chaysosporium對玉米秸稈木質(zhì)素的降解時發(fā)現(xiàn)，在秸稈粒度4～5 cm，接種黃孢原毛平革菌培養(yǎng)35 d后，木質(zhì)素降解率累計率為45.2%。

2.4 酒糟P.chaysosporium預處理前后結構變化分析

2.4.1 電鏡掃描（SEM）分析（圖3）

由圖3可知，與酒糟原料相比經(jīng)P.chaysosporium預處理后殘渣、木質(zhì)纖維結構發(fā)生明顯變化，表面出現(xiàn)凹槽、不規(guī)則孔洞和部分脫落碎屑，結晶區(qū)和非結晶區(qū)界限模糊。殘渣經(jīng)酶解處理，原有的木質(zhì)纖維結構進一步變得疏松，纖維素分子無定形區(qū)消失，結晶區(qū)表面被完全破壞。

表1 P.chaysosporium處理過程中酒糟組分的變化

圖3 酒糟P.chaysosporium預處理及酶解殘渣電鏡掃描圖(×2000)

2.4.2 X衍射（XRD)分析（圖4）

根據(jù)圖 4可知，酒糟在 2θ為 13.10°、21.90°和25.99°處有3個衍射峰，其中2θ=13.10°處左右的弱峰代表纖維素無定形區(qū)，2θ=21.90°代表結晶區(qū)強度的002面衍射峰。經(jīng)P.chaysosporium預處理及酶解后纖維素無定型區(qū)消失，在2θ=22°附近處出現(xiàn)衍射峰，但峰尖不再尖銳[12]。利用Segal經(jīng)驗公式得酒糟原料、P.chaysosporium處理殘渣、酶解殘渣的結晶度分別為25.21%、50.40%和43.67%。表明預處理和酶解能夠提高酒糟相對結晶度，可能的原因是，預處理使得木質(zhì)纖維結構破壞，纖維素分子暴露，尤其是結晶區(qū)的暴露導致002面衍射峰強度增強，結晶度提高。

圖4 酒糟P.chaysosporium預處理及酶解前后X衍射圖譜

2.4.3 紅外光譜（FTIR）分析（圖5）

由圖5紅外光譜分析可知，酒糟經(jīng)P.chayso-sporium預處理后在1310 cm-1、1030 cm-1和833 cm-1處的吸收峰發(fā)生變化明顯，而此處的吸收峰分別代表C-H彎曲振動和纖維素分子內(nèi)醚的C-C骨架的伸縮振動，由上述吸收峰的歸屬可知酒糟中含有木質(zhì)素、纖維素和半纖維素等成分，復合木質(zhì)纖維生物質(zhì)特征。酒糟經(jīng)P.chaysosporium預處理及酶解后有明顯的芳香環(huán)骨架振動伸縮振動峰1640 cm-1，故可知P.chaysosporium預處理及酶解過程并未破壞木質(zhì)素芳香環(huán)結構。酒糟經(jīng)P.chaysosporium作用及酶解后，在1030 cm-1處吸收峰明顯減弱，說明半纖維素被部分降解，故可知，P.chaysosporium處理及酶解前后的譜峰位置基本一致，但吸收峰強度發(fā)生變化，說明酒糟的結構被修飾[13]。

圖5 酒糟P.chaysosporium預處理及酶解前后紅外光譜圖

3 結論

研究結果表明，隨著P.chaysosporium預處理時間的延長，酶解液中還原糖和木糖得率均呈先上升后下降的趨勢,且在P.chaysosporium固態(tài)發(fā)酵時間為8 d時，酶解液中還原糖和木糖得率達到最大值，分別為60.55%和22.12%，與未處理組相比，增長率分別為49.22%和25%。此時預處理殘渣中綜纖維素的保留率和木質(zhì)素的降解率分別為76.85%和26.44%。