河南民權(quán)地區(qū)赤霞珠葡萄表皮酵母菌的多樣性研究

張俊杰，尚益民，程大偉，宋玉婷，楊 旭，陳錦永，劉崇懷

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹(shù)研究所，河南鄭州450009；2.鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州450002）

民權(quán)縣位于河南省東部，地處黃河中下游，以黃河故堤為界，南北形成兩個(gè)不同的地形地貌，堤北高灘地，堤南以青沙、沙堿為主。年平均氣溫14.1℃，年平均降水量674 mm，無(wú)霜期213 d。赤霞珠葡萄適合種植在排水能力強(qiáng)的沙礫質(zhì)土壤中，因此民權(quán)具備種植赤霞珠釀酒葡萄的風(fēng)土條件。并且民權(quán)種植葡萄有1000多年的歷史，素有葡萄之鄉(xiāng)的美稱。所以民權(quán)的葡萄園會(huì)形成一個(gè)獨(dú)特、穩(wěn)定的微生物群落環(huán)境，因此對(duì)于后期葡萄酒的釀造來(lái)說(shuō)，研究民權(quán)葡萄園中葡萄果實(shí)表面的酵母菌的多樣性就顯得尤為重要。

在葡萄酒生產(chǎn)中，酵母對(duì)產(chǎn)量、質(zhì)量和發(fā)酵生產(chǎn)管理影響很大。葡萄表面的野生酵母是最豐富的，成熟葡萄裂果流汁，促使酵母繁殖，果皮蠟質(zhì)有助于這些酵母菌的附著，出現(xiàn)自然發(fā)酵現(xiàn)象[1]。在多年種植葡萄的園區(qū)，天然酵母時(shí)常在葡萄酒生產(chǎn)中，隨同原料進(jìn)入發(fā)酵罐，參與酒的釀造過(guò)程[2]。雖然有商業(yè)葡萄酒酵母可供使用，但一些葡萄酒生產(chǎn)商更傾向于選育葡萄產(chǎn)區(qū)酵母來(lái)生產(chǎn)具有產(chǎn)區(qū)特色的葡萄酒[3-4]，產(chǎn)區(qū)酵母已經(jīng)適應(yīng)了本地的微環(huán)境，易于在葡萄酒發(fā)酵中占主導(dǎo)地位，形成產(chǎn)區(qū)的典型特色[5]。

傳統(tǒng)的釀酒酵母的分類鑒定主要根據(jù)細(xì)胞繁殖類型、產(chǎn)孢子狀況、菌落的顏色、大小和形態(tài)等，以及生理生化試驗(yàn)，再參照《酵母菌的特征和鑒定手冊(cè)》和《微生物分類學(xué)》，進(jìn)行相關(guān)菌種的鑒定，傳統(tǒng)鑒定不僅工作量大、周期長(zhǎng)、操作復(fù)雜且鑒定結(jié)果的重復(fù)性差[6-8]?，F(xiàn)代分子鑒定法主要以核酸作為研究對(duì)象，研究的是基因型，而非表現(xiàn)型，因此能反映其遺傳本質(zhì)[9-11]?，F(xiàn)代分子鑒定法具有穩(wěn)定性好、易確定同源關(guān)系、便于計(jì)算機(jī)分析等優(yōu)點(diǎn)，不僅提高了鑒定的準(zhǔn)確度，而且縮短了鑒定時(shí)間[12]。

河南省境內(nèi)目前已知葡萄屬（Vitis L.）植物有14個(gè)種、1個(gè)亞種及1個(gè)變種[13]。本研究以民權(quán)地區(qū)葡萄園中釀酒葡萄赤霞珠成熟果實(shí)新鮮表皮為原料對(duì)酵母菌[14]進(jìn)行分離和多樣性研究，并確定了民權(quán)赤霞珠葡萄表皮所蘊(yùn)含酵母菌種群的組成以及數(shù)量上的差異。對(duì)于后期葡萄酒的釀造以及提高葡萄酒的質(zhì)量具有一定的指導(dǎo)意義，同時(shí)也會(huì)對(duì)提高民權(quán)地區(qū)葡萄酒的銷量有一定的幫助。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品采集

赤霞珠葡萄原料采自民權(quán)地區(qū)某葡萄園，標(biāo)記為MQ。隨機(jī)采集3棵葡萄植株的葡萄果實(shí)樣品，標(biāo)記為1、2、3，每棵采集3串健康的葡萄，采集日期為2017年9月21日，并在當(dāng)天置于冷凍盒中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，在無(wú)菌條件下按地點(diǎn)收集葡萄的全部葡萄皮，備用。

1.1.2 主要培養(yǎng)基及試劑

培養(yǎng)基：YEPD和WL培養(yǎng)基、Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒（酵母）、26S rDNA D1/D2區(qū)擴(kuò)增引物NL-1和NL-4，見(jiàn)張俊杰等人的研究[15]。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2D超凈工作臺(tái)，蘇州凈化安泰公司；DH-600生化培養(yǎng)箱，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；HH-S恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市醫(yī)療器械有限公司；TGL-16G臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；C1000PCR擴(kuò)增儀，伯樂(lè)；JY023紫外分析儀，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；FD-4new真空干燥機(jī)，鄭州沃邦儀器設(shè)備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 葡萄皮酵母菌富集、分離及純化

實(shí)驗(yàn)方法參見(jiàn)張俊杰研究論文[15]。操作步驟為：在無(wú)菌條件下向滅過(guò)菌的YEPD（含氯霉素）液體培養(yǎng)基中加入葡萄漿果表皮，振蕩培養(yǎng)48 h。梯度稀釋富集液，并選擇10-3、10-4、10-5共3個(gè)梯度稀釋液進(jìn)行YEPD固體平板涂布和培養(yǎng)，隨機(jī)挑去單菌落進(jìn)行純化和保藏。

1.3.2 WL培養(yǎng)基表型鑒定及代表菌株的顯微形態(tài)觀察

挑取YEPD斜面上的酵母菌，在WL培養(yǎng)基上3次劃線并倒置于恒溫培養(yǎng)箱中28℃條件下培養(yǎng)5 d，對(duì)所有菌的菌落形態(tài)進(jìn)行觀察、描述，并拍照記錄[13]，然后根據(jù)菌落表型的差異，對(duì)供試菌株進(jìn)行初步分類并挑選代表菌。然后對(duì)代表菌株進(jìn)行顯微形態(tài)的觀察。顯微形態(tài)觀察在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行，采集代表菌株的顯微形態(tài)照片，并做好記錄。

1.3.3 酵母菌的分子生物學(xué)鑒定

（1）酵母菌26S rDNA D1/D2區(qū)和5.8S-ITS區(qū)序列的PCR擴(kuò)增及檢測(cè)

酵母菌的DNA提取按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行提取，按照過(guò)去的方法擴(kuò)增26S rDNA Dl/D2區(qū)段[15]。使用正向引物ITS1和反向引物ITS4進(jìn)行5.8S-ITS區(qū)基因擴(kuò)增[15]。PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序參照劉愛(ài)國(guó)等人的研究[16]，結(jié)果檢測(cè)參照論文[15]。

（2）PCR產(chǎn)物測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育分析

測(cè)序結(jié)果采用MEGA 6軟件進(jìn)行序列比較，具體方法同張俊杰研究論文中的方法[17]。

1.3.4 酵母菌不同種群數(shù)量分布

上述方法已經(jīng)確定了各個(gè)代表菌所屬種群，用Excel表格統(tǒng)計(jì)各個(gè)種群中各個(gè)代表菌所代表的菌株數(shù)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌的形態(tài)學(xué)觀察及初步聚類分析

2.1.1 葡萄表皮酵母菌的分離、純化與保藏

通過(guò)YEPD液體培養(yǎng)基的富集及固體培養(yǎng)基平板的分離和純化，從民權(quán)地區(qū)葡萄園的赤霞珠葡萄表皮分離純化和保藏酵母菌69株。

2.1.2 酵母菌在WL培養(yǎng)基上的形態(tài)、顯微觀察及初步聚類分析

根據(jù)69株酵母菌在WL培養(yǎng)基上的表型特征，一共得到11種表型，然后，通過(guò)對(duì)每個(gè)表型代表菌株的細(xì)胞顯微形態(tài)觀察，共得到3種顯微形態(tài)，如圖1。詳細(xì)的描述見(jiàn)表1。經(jīng)過(guò)菌落形態(tài)和顯微形態(tài)分析，供試菌被初步分為10個(gè)類型。

圖1 各類型代表菌株在WL培養(yǎng)基上的表型特征（左）和顯微細(xì)胞特征（右）

2.2 酵母菌的26S rDNA D1/D2及5.8S-ITS區(qū)段的PCR鑒定

2.2.1 代表菌株26S rDNA D1/D2區(qū)段的PCR擴(kuò)增分析

分別從以上11類菌株中挑選代表菌株MQ1-1、MQ1-14、MQ1-22、MQ1-23、MQ2-6、MQ2-15、MQ3-8、MQ3-11、MQ3-18、MQ3-21、MQ3-23 進(jìn)行DNA的提取和26S rDNA D1/D2區(qū)段的PCR擴(kuò)增。

2.2.2 26S rDNA D1/D2區(qū)段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序與分析

得到的PCR產(chǎn)物送測(cè)序公司進(jìn)行序列測(cè)定，得到的序列結(jié)果首先在NCBI主頁(yè)，利用BLAST功能與Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)里的已知序列進(jìn)行同源比對(duì)。選擇同源性最高的菌株，一般為99%～100%，然后，選用Mega 6軟件進(jìn)行序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，建立NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，如圖2所示。

其中，MQ3-23與Saturnispora diversa聚為一個(gè)分支，序列相似性為100%，所以MQ3-23可以被鑒定為已知種群Saturnispora diversa。MQ3-18與Pichia terricola處在同一個(gè)分支，序列相似性為100%，因而MQ3-18可以被鑒定為Pichia terricola。代表菌株MQ1-23與Issatchenkia terricola聚在一起，序列相似性為100%，因而被鑒定為Issatchenkia terricola。代表菌 株 MQ2-15、MQ3-8 和MQ3-21與Hanseniaspora vineae處于同一分支，序列相似性為100%，故鑒定為Hanseniaspora vine-ae。而代表菌株 MQ1-1、MQ1-14、MQ1-22 和MQ2-6與已知酵母菌種群Hanseniaspora opuntiae和Hanseniaspora guilliermondii聚為一個(gè)分支，且相似性均為100%，無(wú)法對(duì)這幾株菌進(jìn)行種群確定，所以又對(duì)其進(jìn)行5.8S-ITS區(qū)擴(kuò)增，經(jīng)BLAST分析及5.8S-ITS區(qū)序列相似性計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表2。據(jù)此，這幾個(gè)代表菌株僅有MQ3-11歸為H.guillier-mondii，而其余均歸為H.opuntiae。

表1 酵母菌基于WL培養(yǎng)基的表型聚類結(jié)果

圖2 代表菌株26S rDNA D1/D2區(qū)段的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（鄰接法）

2.3 不同種群中菌株數(shù)量分析

依據(jù)上述對(duì)代表菌分類鑒定結(jié)果，本研究中所分離的68個(gè)菌株共分為4個(gè)屬的6個(gè)種群，其中Saturnispora diversa有15株菌，所占比列為22.1%；Hanseniaspora vineae有16株菌，所占比例為23.5%；Hanseniaspora opuntiae有25株菌，所占比例為36.8%；Hanseniaspora guilliermondii、Pichia terricola和Issatchenkia terricola則分別有2株菌、6株菌和4株菌，共占比例為17.6%。由此可見(jiàn)，種群Hanseniaspora vineae、Hanseniaspora opuntiae和Saturnispora diversa占主導(dǎo)地位，并且種群Hanseniaspora guilliermondii含量最少，種群Hanseniaspora opuntiae占比例最高，各個(gè)種群分布呈現(xiàn)明顯的差異。

表2 供試菌株與相關(guān)菌株的5.8-ITS序列相似性

3 討論

本研究選取民權(quán)地區(qū)的赤霞珠葡萄果皮，通過(guò)富集和分離共得到68個(gè)菌株，最終供試菌被鑒定為4個(gè)已知酵母菌屬的6個(gè)不同種群Hanseniaspora opuntiae、Hansenias pora guilliermondii、Hanseniaspora vineae、Saturnispora diversa、Pichia terricola和Issatchenkia terricola。其中Hanseniaspora opuntiae，Hanseniaspora vineae和Saturnispora diversa占主導(dǎo)。結(jié)合早期張俊杰等[17]關(guān)于鄭州果樹(shù)研究所葡萄種質(zhì)資源圃的赤霞珠葡萄表皮酵母多樣性研究發(fā)現(xiàn)，鄭州果樹(shù)所葡萄皮表面酵母共分為4個(gè)種群，包括Cryptococcus magnus、Cryptococcus uzbekistanensis、Rhodosporidiobolusruineniae和Hanseniaspora uvarum。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，不同的種植環(huán)境下的酵母菌組成有明顯差異，甚至不存在共同的種群。所以研究民權(quán)地區(qū)葡萄表皮酵母菌組成就顯得很有必要。通過(guò)本次研究，初步獲取了民權(quán)地區(qū)赤霞珠葡萄表皮的酵母菌組成特點(diǎn)，并且積累了酵母菌資源。

另外根據(jù)張俊杰等[18]的研究，我們對(duì)比發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)的葡萄表皮酵母菌菌落組成也是有明顯差異的，而且太行山區(qū)野生葡萄果表酵母菌組成與民權(quán)地區(qū)赤霞珠的葡萄果表酵母沒(méi)有共同種群，但與鄭州果樹(shù)所赤霞珠葡萄果表酵母組成有相同種群。結(jié)合楊瑩等[19]的研究，Hanseniaspora opuntiae、Hanseniaspora guilliermondii和Saturnispora diversa在葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中均被大量檢測(cè)到，這一研究說(shuō)明這3個(gè)種群適宜于葡萄酒的發(fā)酵環(huán)境，而Hanseniaspora opuntiae和Saturnispora diversa在民權(quán)地區(qū)的葡萄表皮酵母組成中占主導(dǎo)地位。另外，本研究中分離得到的Saturnispora diversa在國(guó)內(nèi)鮮有報(bào)道，該菌種主要分布在熱帶地區(qū)，曾在印度尼西亞，巴西的熱帶雨林被分離到，在國(guó)內(nèi)，目前僅在廣西有所發(fā)現(xiàn)。

另外，本研究中還發(fā)現(xiàn)屬于同一個(gè)種群的菌株其形態(tài)特征也具有顯著的差異，例如：不同WL表型Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅶ，盡管其形態(tài)特征不一樣，但是經(jīng)過(guò)分子生物學(xué)方法發(fā)現(xiàn)都屬于Hanseniaspora opuntiae。酵母菌種類和表型分析結(jié)果不完全一致，這與張俊杰等[20]之前的研究結(jié)果相一致，所以只有把傳統(tǒng)的鑒定方法與現(xiàn)代分子生物學(xué)鑒定方法相結(jié)合[21]，才可以更加有效而準(zhǔn)確的對(duì)未知酵母菌菌株進(jìn)行分類鑒定。

該研究豐富了我們對(duì)民權(quán)赤霞珠葡萄果皮酵母菌組成的認(rèn)識(shí)，另外還分離出來(lái)在國(guó)內(nèi)很少見(jiàn)的Saturnispora diversa。本研究確定了民權(quán)葡萄表皮酵母菌的菌落組成，對(duì)該地區(qū)種植葡萄以及葡萄酒的釀造具有一定的指導(dǎo)意義，同時(shí)也為打造更具地區(qū)特色的葡萄酒打下堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。