骨髓基質(zhì)細(xì)胞中MGAT3催化的平分型N-糖鏈對(duì)血液細(xì)胞黏附和遷移的影響

張?chǎng)危?龐星辰， 李想，2

(1. 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院， 無(wú)錫 214122； 2. 西北大學(xué) 生命科學(xué)院， 西安 710069)

骨髓造血微環(huán)境(hemopoietic bone marrow microenviorment, HBMM)是由骨髓中鄰近造血干細(xì)胞的特殊細(xì)胞群組成，在干細(xì)胞調(diào)節(jié)、自我更新和分化中起重要作用[1]。骨髓基質(zhì)細(xì)胞是造血微環(huán)境的重要組成之一，在促進(jìn)造血干細(xì)胞生成血細(xì)胞的各個(gè)環(huán)節(jié)中起著十分重要的作用[2]。在研究骨髓基質(zhì)細(xì)胞時(shí)，人骨髓基質(zhì)細(xì)胞HS5、HS27a 是最常用的細(xì)胞株，HS5成纖維狀，能分泌多種細(xì)胞因子如CSF(Colony stimulating factor)、白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)、IL-8 和IL-11 等，而HS27a 呈現(xiàn)出表皮細(xì)胞狀，分泌較低水平的生長(zhǎng)因子[3]。它們與血液細(xì)胞的共培養(yǎng)體系，常被用于研究造血微環(huán)境對(duì)造血干細(xì)胞增殖、分化及凋亡的影響[4-8]。

蛋白質(zhì)N-糖基化是發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中，由多種酶的調(diào)節(jié)，糖供體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和輔助蛋白的協(xié)同作用下的一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程。N-聚糖的特異性及其與內(nèi)源性凝集素的結(jié)合對(duì)于糖蛋白的正確折疊和運(yùn)輸至關(guān)重要[9]。N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶3，即MGAT3，是與N-糖鏈合成或分解代謝相關(guān)的基因。前期研究表明，HS5比HS27a中表達(dá)高水平的MGAT3，MGAT3能催化生成以β-1,4 鍵連接于N-糖鏈β-Man上的平分型GlcNAc[10](圖1)。推測(cè)HS5比HS27a表達(dá)更多的平分型N-糖鏈。蛋白質(zhì)上的平分型N-糖鏈糖基化修飾對(duì)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞黏附、細(xì)胞遷移等生物過(guò)程都有重要影響[11]。MGAT3 催化生成的平分型N-糖鏈能夠抑制細(xì)胞生長(zhǎng)因子途徑，如Ras 信號(hào)途徑，從而抑制腫瘤的增長(zhǎng)和遷移[12]。而MGAT3 催化生成的平分型N-糖鏈在造血微環(huán)境中的作用尚未有深入研究。

圖1 平分型GlcNAc 結(jié)構(gòu)

本文以基質(zhì)細(xì)胞HS5和血液細(xì)胞KG1a和PL-21共培養(yǎng)體系為模型，檢測(cè)HS5細(xì)胞中干擾N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶3(MGAT3)以及對(duì)應(yīng)的平分型N-糖鏈表達(dá)。旨在將為深入研究糖鏈參與骨髓造血微環(huán)境對(duì)血液細(xì)胞的行為提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

HS5是由攜帶人刺瘤病毒E6/E7基因的復(fù)制缺陷型重組逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染人骨髓基質(zhì)細(xì)胞構(gòu)建，HS5和PL-21均獲自美國(guó)Fred-Hutchinson Cancer Research Center (FHCRC) Dr. Deeg實(shí)驗(yàn)室；KG1a細(xì)胞(最初衍生自AML患者)獲自American Type Culture Collection；大腸桿菌JM109及質(zhì)粒pLVX、psPAX2、pMD2.G由本實(shí)驗(yàn)室保存。

RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Biological Industries 公司；細(xì)胞RNA提取試劑盒、無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒、UltraSYBR Mixture (High ROX)購(gòu)于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型)、增強(qiáng)型CCK-8試劑盒、細(xì)胞膜紅色熒光探針、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗小鼠 IgG(H+L)、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔 IgG(H+L)購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；MGAT3抗體購(gòu)于英國(guó)Abcam公司；PHA-E、多聚甲醛購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；Lipofectamine?2000 轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)于Invitrogen 公司；限制性內(nèi)切酶、DNA Ladder marker購(gòu)于TaKaRa公司；反轉(zhuǎn)錄酶、RNase Inhibitor購(gòu)于Toyobo公司。

1.2 方法

1.2.1 MGAT3干擾表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)RNA干擾原則設(shè)計(jì)MGAT3基因的RNA干擾序列，利用分子克隆手段構(gòu)建重組質(zhì)粒pLVX-shNC 、pLVX-shMGAT3-1、pLVX-shMGAT3-2。用菌落PCR方法篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。電泳雙酶切驗(yàn)證后送至上海睿迪生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。得到正確的重組質(zhì)粒pLVX-shNC 、pLVX-shMGAT3-1、pLVX-shMGAT3-2。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞株均培養(yǎng)在含10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS)、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件為37℃, 5% CO2。

1.2.3 細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

將生長(zhǎng)良好的293T細(xì)胞傳代至T25培養(yǎng)瓶，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%時(shí)，換新鮮培養(yǎng)基，放于細(xì)胞培養(yǎng)箱等待轉(zhuǎn)染。準(zhǔn)備2個(gè)離心管，分別加入250 μL DMEM培養(yǎng)基，其中一管加入250 μL Lipofectamine? 2000 轉(zhuǎn)染試劑，另一管加入5 μg重組質(zhì)粒、3.75 μg psPAX2和1.25 μg pMD2.G混合均勻。將2個(gè)離心管混合吹勻，室溫孵育5 min后轉(zhuǎn)移至293T細(xì)胞培養(yǎng)液中搖勻。轉(zhuǎn)染時(shí)間48 h。收集293T細(xì)胞上清液，過(guò)濾后于-80℃保存。

將待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞傳至12孔板，生長(zhǎng)至10%即可轉(zhuǎn)染。吸入原有培養(yǎng)基，加入1 mL病毒液，4 h后加入1 mL完全培養(yǎng)基，24 h后吸去含有病毒的培養(yǎng)液，換成新鮮的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后可用含有1 μg/mL puro抗生素的培養(yǎng)基篩選。擴(kuò)大培養(yǎng)后，用RT-PCR及蛋白質(zhì)免疫印跡驗(yàn)證，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

用細(xì)胞RNA提取試劑盒(CW0560康為世紀(jì))提取細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用UltraSYBR Mixture (High ROX)試劑盒，每組數(shù)據(jù)3次平行進(jìn)行PCR。反應(yīng)體系為Mix buffer 7.5 μL、上游引物(10 μmol/L)0.3 μL、下游引物(10 μmol/L)0.3 μL、模板cDNA 1.2 μL、ddH2O 5.7 μL。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10 min；95℃變性15 s，60℃退火60 s，72℃延伸5 min，共40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用2-ΔΔCT方法量化目的基因的倍性變化[13]。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡

胰酶消化細(xì)胞并收集，預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞3次，加入蛋白裂解液(1 mL RIPA、1%蛋白酶抑制劑)冰上裂解30 min，14 000 r/min離心15 min。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，加入5×loading Buffer煮沸5 min。取等量蛋白樣品上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，電泳后將蛋白質(zhì)樣品轉(zhuǎn)移至0.45 μm PVDF膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用5%脫脂牛奶的TBST溶液37℃封閉1～2 h，加入一抗(比例按照抗體說(shuō)明)4℃過(guò)夜孵育。TBST洗滌5次，加入相同屬源的二抗室溫孵育1 h，TBST洗5次，用Pro-light HRP化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑顯色，并于ChemiDocTM XRS+凝膠成像系統(tǒng)掃描成像。

1.2.6 凝集素印跡

樣品處理、電泳及轉(zhuǎn)膜步驟同蛋白質(zhì)印跡，轉(zhuǎn)膜后用含5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)的PBST封閉液37℃封閉1～2 h，加入生物素標(biāo)記的凝集素4℃過(guò)夜孵育。PBST洗滌5次，用VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit室溫孵育1 h，PBST洗滌5次，Pro-light HRP化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑顯色，并于ChemiDocTM XRS+凝膠成像系統(tǒng)掃描成像。

1.2.7 凝集素細(xì)胞染色

將滅菌圓形蓋玻片置于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，接種適量細(xì)胞培養(yǎng)至80%左右。PBS洗 3次，加入新鮮的4%多聚甲醛液室溫固定15 min。棄固定液，PBS 洗3～5 次，加入2% Triton-100通透液室溫通透10 min。棄通透液，PBS 洗3～5次，5% 牛血清蛋白(bovine serum albumin，BSA) 溶液4℃過(guò)夜封閉。PBS洗3次，然后用Cy3 標(biāo)記好的濃度為5 μg/mL PHA-E室溫避光孵育3 h，PBS洗3 遍，5 μg/mL 4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI) 避光染色10 min，將玻片倒扣在滴有Glycergel 固封劑的載玻片上，用leica TCS SP8共聚焦顯微鏡下拍照觀察。

1.2.8 細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)

將基質(zhì)細(xì)胞接種于96孔板培養(yǎng)12～24 h使細(xì)胞單層平鋪于板底。KG1a、PL-21細(xì)胞用DiI細(xì)胞膜紅色熒光探針標(biāo)記，于不含血清的培養(yǎng)基中饑餓培養(yǎng)4 h。將饑餓處理后的KG1a、PL-21細(xì)胞按10∶3細(xì)胞量比例加入到培養(yǎng)基質(zhì)細(xì)胞的96孔板中，共培養(yǎng)2 h，使KG1a、PL-21細(xì)胞貼壁。吸出非貼壁細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液PBS洗滌3次，使用熒光酶標(biāo)儀測(cè)量熒光強(qiáng)度。

1.2.9 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

將基質(zhì)細(xì)胞鋪于24孔transwell板下室，KG1a、PL-21細(xì)胞用DiI細(xì)胞膜紅色熒光探針標(biāo)記，于不含血清的培養(yǎng)基中饑餓培養(yǎng)4 h。將饑餓處理后的腫瘤細(xì)胞按10∶3細(xì)胞量比例加入transwell板上室。37℃培養(yǎng)4 h，吸出上室細(xì)胞，使用酶標(biāo)儀測(cè)量上室膜上細(xì)胞熒光強(qiáng)度。

1.2.10 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞鋪于96孔板，每孔100 μL約2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞貼壁后每孔加入10 μL CCK-8溶液。在培養(yǎng)箱中孵育，以無(wú)細(xì)胞空白培養(yǎng)基和CCK-8溶液為對(duì)照，分別在0.5、1、1.5和2 h后用酶標(biāo)儀檢測(cè)，選出吸光度比較合適的時(shí)間點(diǎn)作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的時(shí)間檢測(cè)點(diǎn)。 接種對(duì)照組和干擾組細(xì)胞24、48、72、96 h后在450 nm測(cè)定吸光度。

1.2.11 數(shù)據(jù)分析

用Gel-pro進(jìn)行凝膠電泳及熒光定量分析。采用PraphPad Prism 5進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 MGAT3干擾質(zhì)粒的構(gòu)建及驗(yàn)證

根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法構(gòu)建pLVX-shNC 、pLVX-shMGAT3-1、pLVX-shMGAT3-2。菌落PCR篩選出陽(yáng)性克隆，電泳圖中顯示片段大小分別為150、150，符合預(yù)期(圖2)。 基因測(cè)序結(jié)果表示pLVX-shMGAT3-1、pLVX-shMGAT3-2構(gòu)建成功。

1：DL1000 DNA Marker；2：重組質(zhì)粒pLVX-shMGAT3-1；3：pLVX-shMGAT3-2

圖2重組干擾質(zhì)粒pLVX-shMGAT3-1、pLVX-shMGAT3-2的菌落PCR驗(yàn)證

Fig 2 Verification of pLVX-shMGAT3-1, pLVX-shMGAT3-2 recombinant interference plasmid by bacterial colony PCR

2.2 干擾 MGAT3的細(xì)胞株篩選

提取HS5-shNC 、HS5-shMGAT3-1、HS5-shMGAT3-2細(xì)胞中的RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用RT-PCR定量分析3種細(xì)胞中MGAT3基因的表達(dá)差異。發(fā)現(xiàn)在HS5-shMGAT3-1、HS5-shMGAT3-2中MGAT3基因表達(dá)量明顯降低(圖3-A)。提取3株細(xì)胞株中的總蛋白，進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn), 分析MGAT3蛋白水平上的差異。結(jié)果證實(shí)，MGAT3干擾細(xì)胞株中MGAT3蛋白質(zhì)水平的表達(dá)明顯降低(圖3-B)。

A：MGAT3轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)；B： MGAT3蛋白水平檢測(cè)；C： MGAT3蛋白水平檢測(cè)量化圖。*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001

圖3 HS5細(xì)胞中構(gòu)建沉默MGAT3的驗(yàn)證

Fig 3 Validation the construction of HS5-shMGAT3 cells

2.3 干擾細(xì)胞株中平分型糖鏈的檢測(cè)

通過(guò)檢測(cè)干擾后細(xì)胞與凝集素PHA-E的不同結(jié)合能力分析干擾前后細(xì)胞株中平分型N-糖鏈的差異。結(jié)果表明MGAT3的沉默使得干擾細(xì)胞株的平分型N-糖鏈表達(dá)水平降低(圖4)。

A：MGAT3干擾細(xì)胞株中平分型N-糖鏈表達(dá)檢測(cè)；B：細(xì)胞凝集素染色檢測(cè)平分型N-糖鏈表達(dá)，DIPA(藍(lán)色)染色細(xì)胞核；連接Cy3的PHA-E(紅色)染色平分型糖鏈；C：細(xì)胞凝集素染色量化圖。*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001

圖4沉默MGAT3后HS5中平分型N-糖鏈表達(dá)的驗(yàn)證

Fig 4 Validation expression of bisecting GlcNAc in HS5 cells after inhibiting MGAT3

2.4 MGAT3干擾后對(duì)基質(zhì)細(xì)胞增殖的影響

以HS5-shNC為例測(cè)0.5、1、1.5、2 h時(shí)450 nm吸光度值，結(jié)果可知1 h為適宜時(shí)間點(diǎn)(圖5-A)。將干擾MGAT3后的HS5細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞進(jìn)行CCK-8實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示干擾MGAT3后HS5的增殖能力無(wú)明顯變化(圖5-B)。

A：吸光值為0.5左右的時(shí)間為最適時(shí)間點(diǎn)；B：CCK-8測(cè)量細(xì)胞增殖圖

圖5干擾MGAT3對(duì)HS5細(xì)胞株的影響

Fig 5 Effect of silencing MGAT3 on cell proliferation of HS5

2.5 HS5中干擾MGAT3后對(duì)KG1a、PL-21細(xì)胞黏附的影響

將上述獲得的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞、對(duì)照組細(xì)胞分別與KG1a、PL-21共培養(yǎng)，觀察KG1a、PL21細(xì)胞的黏附，結(jié)果表明KG1a、PL-21細(xì)胞對(duì)基質(zhì)細(xì)胞的黏附能力在MGAT3干擾后受到明顯抑制(圖6)。

*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001

圖6 HS5細(xì)胞中干擾MGAT3對(duì)KG1a和PL-21細(xì)胞黏附的影響

Fig 6 Cell adhesion of KG1a and PL-21 after co-cultured with HS5 or modified HS5 cells

2.6 MGAT3干擾后對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移的影響

將上述獲得的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞、對(duì)照組細(xì)胞與KG1a、PL21共培養(yǎng)，觀察KG1a、PL21細(xì)胞的遷移，KG1a、PL21細(xì)胞對(duì)基質(zhì)細(xì)胞的遷移能力在MGAT3干擾后受到明顯抑制(圖7)。

*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001

圖7 HS5細(xì)胞中干擾MGAT3對(duì)KG1a和PL-21細(xì)胞遷移的影響

Fig 7 Cell migration of KG1a and PL-21 after co-cultured with HS5 or modified HS5 cells

3 討論與結(jié)論

在腫瘤微環(huán)境中，糖鏈表達(dá)變化能使腫瘤細(xì)胞發(fā)生類似于發(fā)育過(guò)程中受體的激活，細(xì)胞黏附和細(xì)胞遷移的變化等。也有研究表明在人黑色素瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)MGAT3使黑素瘤細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)[9]。在乳腺癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)MGAT3 導(dǎo)致平分型N-糖鏈表達(dá)增強(qiáng)，抑制小鼠的代謝活性，可以顯著延緩小鼠乳腺腫瘤的發(fā)展[14]。而平分型N-糖鏈在造血微環(huán)境中的作用研究尚未深入。

本實(shí)驗(yàn)利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了沉默MGAT3的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染型細(xì)胞株HS5-shMGAT3。由于MGAT3 催化生成以β-1,4 鍵連接于N-糖鏈β-Man 上的平分型GlcNAc。利用凝集素染色和細(xì)胞染色方法檢測(cè)到HS5-shMGAT3中平分型N-糖鏈表達(dá)下調(diào)，與預(yù)測(cè)相一致。

造血微環(huán)境的異常往往伴隨著基質(zhì)細(xì)胞上某些糖蛋白及蛋白上的糖鏈表達(dá)異常。例如，Glavey等[15]研究證明在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中干擾β-半乳糖苷α-2,3唾液酸轉(zhuǎn)移酶，即ST3GAL6，能夠抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞向骨髓基質(zhì)細(xì)胞的黏附和遷移。我們的研究發(fā)現(xiàn)基質(zhì)細(xì)胞中MGAT3基因沉默改變了血液細(xì)胞KG1a、PL-21的黏附能力和遷移能力。有報(bào)道證明，分子水平上MGAT3 及平分型GlcNAc 結(jié)構(gòu)通過(guò)改變黏附分子及細(xì)胞外基質(zhì)，如上皮細(xì)胞鈣黏蛋白(E-cadherin)、層黏連蛋白(laminin)及整合素(integrin)的N-糖基化修飾來(lái)影響細(xì)胞黏附與遷移[16-18]。而在共培養(yǎng)體系中，糖鏈在造血微環(huán)境中如何調(diào)控血液細(xì)胞的黏附和遷移能力是我們下一步研究的重點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)骨髓基質(zhì)細(xì)胞HS5中MGAT3催化的平分型N-糖鏈對(duì)血液細(xì)胞KG1a、PL-21黏附和遷移有重要作用，為進(jìn)一步基質(zhì)細(xì)胞表面糖鏈的差異對(duì)血液細(xì)胞的不同生物學(xué)功能提供了理論依據(jù)。實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的MGAT3干擾細(xì)胞株為研究共培養(yǎng)時(shí)對(duì)血液細(xì)胞增殖、凋亡等相關(guān)信號(hào)通路的變化提供良好的細(xì)胞模型，也為深入研究糖鏈參與骨髓造血微環(huán)境對(duì)血液細(xì)胞再生和分化的作用奠定研究基礎(chǔ)。