層層自組裝復(fù)合電極用于檢測(cè)牛奶中三聚氰胺

李萌萌， 李冬迪， 羅仙科， 郭 卓

(沈陽化工大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院， 遼寧 沈陽 110142)

三聚氰胺(Melamine,C3H6N6)是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物，作為一種化工原料常被添加到塑料、纖維和膠水中以提高產(chǎn)品性能.由于三聚氰胺中氮的含量約占66 %(質(zhì)量分?jǐn)?shù))[1]，比蛋白質(zhì)還高，并且價(jià)格低廉[2]，所以，一些不法商販為了個(gè)人利益將其加到乳制品或食品中，造成高蛋白的假象.長(zhǎng)期攝入三聚氰胺不僅會(huì)導(dǎo)致生殖、泌尿系統(tǒng)的損害、衰竭[3]，甚至還會(huì)造成死亡.因此，準(zhǔn)確快速地檢測(cè)出牛奶中的三聚氰胺對(duì)于保證食品安全具有非常重要的意義.

目前，檢測(cè)三聚氰胺的方法有很多，比如：高效液相色譜法(HPLC)[4],氣相/液相色譜-質(zhì)譜分析法(GC/LC-MS)[5-6]，聯(lián)酶免疫吸附測(cè)定法(ELISAS)[7]及毛細(xì)管電脈質(zhì)譜分析法(CE-MS)[8]等.這些方法的弊端在于需要貴重的檢驗(yàn)設(shè)備和復(fù)雜的預(yù)處理過程，不適用于常規(guī)的檢測(cè).而電化學(xué)檢測(cè)方法是一種操作簡(jiǎn)單、靈敏度高的分析方法，它可以用于食品中三聚氰胺的檢測(cè)[9].

金納米粒子具有良好的生物相容性、良好的光學(xué)和電學(xué)特性，被廣泛應(yīng)用于三聚氰胺的檢測(cè).例如， Su 等[10]制備金納米粒子，用3-巰基丙磺酸鹽修飾后加入預(yù)處理過的含有三聚氰胺的嬰兒奶粉溶液中，與奶粉中三聚氰胺結(jié)合后，溶液由紅色變成了藍(lán)色，可以對(duì)三聚氰胺進(jìn)行檢測(cè)；Ai等[11]采用MTT(1-(2-巰基乙基)-1，3，5-三嗪-2，4，6-三酮)修飾的金納米探針測(cè)定三聚氰胺，具有較高靈敏度；Liang等[12]采用巰基乙胺修飾金納米探針，實(shí)現(xiàn)了奶粉中三聚氰胺的檢測(cè).

氧化石墨烯(GO)是由碳原子構(gòu)成二維片狀結(jié)構(gòu)，其表面含有很多的含氧官能團(tuán)，在水中易分散，比表面積大，具有很好的導(dǎo)電性能，在生物檢測(cè)和電容器方面具有廣泛的應(yīng)用.本實(shí)驗(yàn)采用的是電化學(xué)方法.首先，將氧化石墨烯涂到電極上，制備GO/GCE修飾電極；然后，利用層層自組裝方法，把1，4-二硫蘇糖醇(DTT)、金納米粒子、L-半胱氨酸(L-Cys)組裝到GO/GCE修飾電極表面，制備了GO/DTT/AuNPs/L-Cys/GCE復(fù)合電極；此復(fù)合電極與三聚氰胺之間產(chǎn)生氫鍵作用，可以對(duì)牛奶中痕量的三聚氰胺產(chǎn)生響應(yīng).同時(shí)，該方法簡(jiǎn)單方便，成本低，易于推廣，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)三聚氰胺的高選擇、高靈敏的檢測(cè).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

氯金酸(HAuCl4)、L-半胱氨酸(L-Cys)、檸檬酸鈉、納米石墨粉均購于上海阿拉丁試劑有限公司；1,4-二硫代蘇糖醇(DTT)、鐵氰化鉀均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(上海)；三聚氰胺、濃硫酸、雙氧水、鹽酸、高錳酸鉀、硝酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、乙醇、丙酮和氯化鉀試劑均購于天津化學(xué)試劑公司；磷酸鹽緩沖溶液(PBS)按標(biāo)準(zhǔn)配制成不同 pH 溶液.所有試劑均為分析純.實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水.玻碳電極的處理：將電極在麂皮上用氧化鋁粉拋光，依次用丙酮、乙醇、蒸餾水各超聲10 min，烘干，備用.

Autolab-PGSTAT302N 電化學(xué)工作站購于瑞士萬通中國有限公司.三電極系統(tǒng)：工作電極為修飾的玻碳電極，輔助電極為鉑絲，參比電極為飽和甘汞電極.檢測(cè)方法有循環(huán)伏安法(CV)、微分脈沖伏安法(DPV)和電化學(xué)阻抗(EIS).NICOLET-560 型紅外光譜儀購于美國 Nicilet 公司，光譜區(qū)域 400～4 000 cm-1.透射電子顯微鏡(H-600)，日本株式會(huì)社日立制作所.

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1 氧化石墨烯(GO)的制備

采用傳統(tǒng)Hummers[13]法來制備GO.GO的制備：在冰水浴條件下，往三口瓶中加入0.6 g納米石墨(40 nm)和1.0 g NaNO3，再倒入35 mL冷藏的濃H2SO4，攪拌40 min；再稱取3 g KMnO4，緩慢加入三口燒瓶中，繼續(xù)攪拌2 h；撤掉冰浴并將反應(yīng)體系溫度升至35 ℃，在此溫度下繼續(xù)攪拌30 min；接著將150 mL去離子水緩慢加入體系中，將反應(yīng)體系升溫至98 ℃，繼續(xù)攪拌15 min；最后，將反應(yīng)完的溶液緩慢倒入提前預(yù)熱的200 mL去離子水中攪拌，隨后向溶液中滴加雙氧水至沒有氣泡產(chǎn)生，靜置分層將上層清液倒出，下層溶液用蒸餾水洗至中性，離心分離，得到GO分散液.

1.2.2 納米金的制備

納米金溶液的制備[14]：取1 mL摩爾分?jǐn)?shù)為0.01 %的氯金酸(HAuCl4)溶液加入到100 mL去離子水中，然后向其中迅速加入1 mL摩爾分?jǐn)?shù)為1 %的檸檬酸鈉水溶液，在100 ℃的條件下加熱攪拌30 min；溶液會(huì)從淺藍(lán)色變成紫紅色，最后形成酒紅色金納米粒子(AuNPs)溶液.

1.2.3 GO/DTT/AuNPs/L-Cys/GCE納米修飾電極的制備

將上述制備好的氧化石墨烯配成1 g/L溶液，涂在已處理好的玻碳電極上，真空干燥；然后采用自組裝的方法，將氧化石墨烯修飾的玻碳電極浸泡在濃度為50 mmol/L DTT 的乙醇溶液中12 h，然后用蒸餾水沖洗；再將電極浸入到制備好的金納米粒子溶液中，讓電極在4 ℃冰箱內(nèi)組裝24 h，蒸餾水清洗；再浸泡在濃度為20 mmol/L的L-Cys溶液中12 h，取出電極后用超純水沖洗干凈后待用.

1.2.4 奶粉樣品的處理

精密稱取牛奶樣品，加入乙腈，充分振蕩，然后添加一定量三聚氰胺標(biāo)液，用pH=7.0的PBS緩沖溶液稀釋至100 mL，在10 000 r/min速度下離心10 min，取上清液作為提取液.取提取液1 mL，用5 mmol/L K3[Fe(CN)6](pH=6.80)溶液稀釋到10 mL，采用DPV法進(jìn)行檢測(cè)，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)樣品的回收率.

2 結(jié)果與討論

2.1 氧化石墨烯和Au納米粒子的表征

圖1 為氧化石墨烯和金粒子的透射電子顯微鏡圖.從圖1可以看出：氧化石墨烯成片層結(jié)構(gòu)，有很多小褶皺，具有大的比表面積；金納米粒子的粒徑大約是50 nm.

圖1 氧化石墨烯和金納米粒子的TEM

2.2 電極的層層自組裝

由圖2(a)可知：石墨粉被氧化后表面包含了很多的含氧官能團(tuán)，在3 400 cm-1處出現(xiàn)了一個(gè)較寬、較強(qiáng)的吸收峰，這是—OH 的伸縮振動(dòng)峰；在 1 723 cm-1、1 386 cm-1和1 050 cm-1出現(xiàn)的吸收峰分別為C==O伸縮振動(dòng)、—OH 的變形振動(dòng)以及C—O的伸縮振動(dòng)[15].當(dāng)將GO/GCE電極浸泡在DTT中時(shí)，如圖2(b)，—OH的吸收峰變強(qiáng)，并且在2 556 cm-1和600 cm-1出現(xiàn)了新的吸收峰，分別為—SH和—C—S—的振動(dòng)峰，說明DTT組裝在GO上[16].在GO/GCE電極浸入金納米溶膠后[圖2(c)],—SH從2 556 cm-1移動(dòng)到2 543 cm-1，說明Au納米粒子與—SH發(fā)生了配位.電極浸泡在L-Cys溶液中，如圖2(d)所示，新出現(xiàn)的吸收峰為1 651 cm-1和1 400 cm-1，分別是—N—H的彎曲振動(dòng)及—C—N—的伸縮振動(dòng)[17]，說明各物質(zhì)層層自組裝在玻碳電極上.當(dāng)電極與Melamine發(fā)生氫鍵作用時(shí)[圖2(e)]，在3 469 cm-1、3 421 cm-1、3 135 cm-1處出現(xiàn)了N—H的伸縮振動(dòng)峰[18]，1 554 cm-1是C==N的伸縮振動(dòng)峰[19],同時(shí)，1 723 cm-1處C==O的峰變?nèi)?，說明三聚氰胺與L-Cys形成了氫鍵.

(a) GO (b) GO-DTT (c) GO-DTT-AuNPs(d) GO-DTT-AuNPs-L-Cys (e) GO-DTT-AuNPs-L-Cys-Melamine

2.3 修飾電極的電化學(xué)性能

如圖3所示，在1.0 mmol/L的[Fe(CN)6]3-/4-(包含0.5 mol/L KCl)的混合溶液中，在-0.2～0.6 V 的電壓范圍，以100 mV/s的掃描速率內(nèi)對(duì)不同的修飾電極進(jìn)行CV掃描，并將各CV曲線進(jìn)行對(duì)比.圖中裸電極(曲線a)有一對(duì)清晰的氧化還原峰，ΔEp為0.13 V.當(dāng)修飾氧化石墨烯后(曲線b)，氧化還原峰明顯變?nèi)?這是因?yàn)檠趸┍砻嬗泻芏嗪趸鶊F(tuán)，阻礙了電子轉(zhuǎn)移.對(duì)于電極GO/DTT/GCE(曲線c)，當(dāng)加入DTT以后，氧化還原峰繼續(xù)變小，ΔEp增大.這是因?yàn)镈TT是惰性傳質(zhì)層[20]，阻礙了電子傳遞到玻碳電極表面上[21].當(dāng)組裝Au膠體后(曲線d)，由于Au具有非常好的導(dǎo)電能力，氧化還原峰電流增大，促進(jìn)了[Fe(CN)6]3-/4-電子之間的轉(zhuǎn)移.當(dāng)組裝L-Cys后(曲線e)，L-Cys電子傳遞能力較差，曲線的氧化還原峰電流值降低.此結(jié)果說明各組分很好地組裝在一起，相互作用，形成了很好的GO/DTT/AuNPs/L-Cys/GCE電極.

圖4為不同電極的EIS圖，阻抗的檢測(cè)頻率范圍在0.1～105Hz.根據(jù)Nyquist(EIS)圖在高頻處半圓的直徑和等效電路圖，可以大約計(jì)算出電子轉(zhuǎn)移電阻[9].曲線a為空白電極，它的電子轉(zhuǎn)移電阻為194 Ω；電極修飾GO后(曲線b)，其半圓直徑變大，導(dǎo)電的速率降低，電阻為343 Ω；與GO/GCE相比，電極GO/DTT/GCE阻抗增大(曲線c)，這是因?yàn)镈TT阻礙了電子的轉(zhuǎn)移，降低了其電導(dǎo)率.組裝金膠體后(曲線d)，半圓的直徑明顯變小，其電阻降低至129 Ω；曲線e為GO/DTT/AuNPs/L-Cys/GCE復(fù)合電極的阻抗，導(dǎo)電性能比GO/DTT/AuNPs低，電子轉(zhuǎn)移的阻抗值為241 Ω.說明了此電化學(xué)傳感器的電極通過層層組裝，很好地結(jié)合在一起，并且形成了良好的GO/DTT/AuNPs/L-Cys/GCE電極，與CV檢測(cè)的結(jié)果一致.

(a) bare/GCE (b) GO/GCE (c) GO/DTT/GCE(d) GO/DTT/AuNPs/GCE (e) GO/DTT/AuNPs/L-cys/GCE

(a) bare/GCE、(b) GO/GCE、c.GO/DTT/GCE、(d) GO/DTT/AuNPs/GCE (e)GO/DTT/AuNPs/L-cys/GCE

2.4 GO/DTT/AuNPs/L-Cys/GCE電極對(duì)三聚氰胺的檢測(cè)原理

層層自組裝(LBL) 以正負(fù)電荷間的靜電作用為驅(qū)動(dòng)力，通過帶相反電荷的單元交替沉積構(gòu)筑逐層組裝多層膜.當(dāng)用組裝好的GO/DTT/AuNPs/L-Cys/GCE修飾電極來檢測(cè)三聚氰胺溶液時(shí)，工作原理如圖5所示.

圖5 GO/DTT/AuNPs/L-Cys/GCE電極對(duì)三聚氰胺的檢測(cè)原理

三聚氰胺沒有電化學(xué)活性，但能與L-Cys上的羧基發(fā)生氫鍵作用，生成的物質(zhì)具有電化學(xué)響應(yīng)；并且隨著三聚氰胺濃度的增加，產(chǎn)生的電化學(xué)響應(yīng)增大，因此，可用于三聚氰胺檢測(cè).

2.5 反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.5.1 pH對(duì)峰電流的影響

圖6是5.0 × 10-4mol/L的三聚氰胺在不同pH(5.8～8.0)的磷酸鹽緩沖溶液中的DPV響應(yīng).pH在5.8～7.0范圍內(nèi)，在pH達(dá)到7.0時(shí)，峰電流達(dá)到最大值；pH繼續(xù)增大，峰電流逐漸變小.所以，當(dāng)pH=7.0時(shí)檢測(cè)三聚氰胺的結(jié)果最佳.

圖6 不同pH對(duì)峰電流的影響

2.5.2 DDT濃度對(duì)峰電流的影響

從圖7中可以看出：在DTT濃度比較低時(shí)，電流隨著DTT濃度的增加而增大，在DTT濃度為50 mmol/L時(shí)電流達(dá)到最大；隨后，隨著DTT濃度的增加而電流逐漸降低.這是因?yàn)椋S著DTT濃度的增加，有更多的DTT分子與氧化石墨烯自組裝到一起，有更多的巰基與Au配位，進(jìn)而與更多的三聚氰胺分子產(chǎn)生響應(yīng)；但是，隨著DTT濃度的進(jìn)一步增大，電極傳輸電子的能力降低，從而電流逐漸減小.所以，在后面的實(shí)驗(yàn)中選用DTT的濃度為50 mmol/L.

圖7 DDT濃度對(duì)峰電流的影響

2.5.3 L-Cys濃度對(duì)峰電流的影響

從圖8中可以看出：電流隨著L-Cys濃度的增加而增大，在L-Cys濃度為20 mmol/L時(shí)達(dá)到最大，隨后隨著L-Cys濃度的增加電流逐漸降低.這是因?yàn)椋矍璋放cL-Cys上的羧基發(fā)生氫鍵作用，生成的物質(zhì)具有電化學(xué)響應(yīng)，隨著L-Cys濃度的增加，更多的L-Cys分子與三聚氰胺發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生的電化學(xué)響應(yīng)增大；但是隨著L-Cys濃度的繼續(xù)增大，反應(yīng)生成的物質(zhì)使電極厚度增加，阻礙了電子的傳輸，使電流下降；在L-Cys的濃度是20 mmol/L時(shí)達(dá)到最大值.在后面的實(shí)驗(yàn)中選用L-Cys的濃度為20 mmol/L.

圖8 L-Cys濃度對(duì)峰電流的影響

2.5.4 GO/DTT/AuNPs/L-Cys/GCE電極與三聚氰胺作用時(shí)間對(duì)峰電流的影響

復(fù)合電極與三聚氰胺作用時(shí)間對(duì)峰電流的影響如圖9所示.

圖9 GO/DTT/AuNPs/L-Cys/GCE電極與三聚氰胺作用時(shí)間對(duì)峰電流的影響

從圖9中可以看出：GO/DTT/AuNPs/L-Cys/GCE電極與三聚氰胺作用時(shí)間達(dá)到12 h時(shí)，產(chǎn)生的電流響應(yīng)最大.這是因?yàn)?，隨著電極與三聚氰胺作用時(shí)間的增加，更多的三聚氰胺分子配位到電極表面，使電流增加；但是，隨著作用時(shí)間繼續(xù)增加，三聚氰胺在電極表面飽和，繼續(xù)增加作用時(shí)間，電流反而減小.所以，在后面的實(shí)驗(yàn)中選用作用時(shí)間為12 h.

2.6 三聚氰胺的檢測(cè)

在0.1 mol/L pH=7.0的磷酸鹽緩沖溶液中，GO/DTT/AuNPs/L-Cys/GCE修飾電極對(duì)1.0×10-7～1.0×10-3mol/L的三聚氰胺溶液進(jìn)行DPV檢測(cè)，結(jié)果如圖10所示.

a 1.0×10-7 mol/L b 8.0×10-7 mol/Lc 3.0×10-6 mol/L d 5.0×10-6 mol/Le 1.0×10-5 mol/L f 2.0×10-4 mol/Lg 6.0×10-4 mol/L h 1.0×10-3 mol/L

從圖10曲線a～h可以看出：隨著三聚氰胺濃度的不斷增大，氧化峰的電流也在逐漸增大.三聚氰胺濃度與峰電流值在1.0×10-7～1.0×10-5mol/L和1.0×10-5～1.0×10-3mol/L范圍內(nèi)分別成線性關(guān)系，其線性方程為：

Ipa=11.17+0.85c

(Ipa:μA，c:μmol/L)

(1.0×10-7～1.0×10-5mol/L，R=0.995)

(S/N=3)

Ipa=13.48+0.02c

(Ipa:μA，c:μmol/L)

(1.0×10-5～1.0×10-3mol/L，R=0.992)

(S/N=3)

其最低檢測(cè)限為1.0×10-8mol/L.

2.7 電極的重復(fù)性和穩(wěn)定性

為了檢測(cè)GO/DTT/AuNPs/L-Cys/GCE電極的重復(fù)性，對(duì)pH=7.0， 5.0 × 10-4mol/L的三聚氰胺溶液檢測(cè)8次.8次檢測(cè)的峰電流相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.42 %，說明該電極具有良好的重現(xiàn)性.再將制備好的電極在空氣中放置21 d，然后進(jìn)行檢測(cè).檢測(cè)結(jié)果比初始結(jié)果下降了2.8 %，表明該修飾電極的穩(wěn)定性良好，使用壽命長(zhǎng)，可以廣泛地應(yīng)用.

2.8 實(shí)際樣品的檢測(cè)

考察GO/DTT/AuNPs/L-Cys/GCE電極對(duì)牛奶中三聚氰胺的檢測(cè).采用標(biāo)準(zhǔn)加入法，在牛奶樣品中加入不同濃度的三聚氰胺，經(jīng)預(yù)處理后，用DPV法測(cè)試其濃度，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1.

表1 修飾電極檢測(cè)牛奶樣品中三聚氰胺的回收率

3 結(jié) 論

首先制備了氧化石墨烯修飾電極，然后將1，4-二硫蘇糖醇、金納米粒子、L-半胱氨酸通過層層自組裝方法組裝在氧化石墨烯修飾電極表面上，用來檢測(cè)牛奶中三聚氰胺含量.結(jié)果表明，由于修飾電極與三聚氰胺之間有氫鍵作用，使響應(yīng)電信號(hào)增強(qiáng)，峰電流值變大.該電極制備經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)單，檢測(cè)范圍在1.0 × 10-7～1.0 ×10-3mol/L，最低檢測(cè)限是1.0 × 10-8mol/L.該電極的重復(fù)性和穩(wěn)定性良好，可廣泛用于奶制品中三聚氰胺的檢測(cè).