野火球、野豌豆繁殖技術(shù)研究

， ， ， 徐華，

(1.花卉種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種北京市重點實驗室， 北京 100083； 2.國家花卉工程技術(shù)研究中心， 北京 100083； 3.城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實驗室， 北京 100083； 4.林木花卉遺傳育種教育部重點實驗室， 北京 100083； 5.北京林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院， 北京 100083； 6.內(nèi)蒙古赤峰市克什克騰旗樺木溝林場， 內(nèi)蒙古 赤峰 025366)

野火球、野豌豆為蝶形花科多年生草本植物?；ㄉG麗，植株秀美，對干旱寒冷地區(qū)適應(yīng)性好，管理粗放，可作為觀賞植物開發(fā)，用于節(jié)約型園林的建設(shè)。此外，二者均可入藥。20世紀(jì)90年代前人對野火球組織培養(yǎng)技術(shù)進行了研究[1-6]，并建立再生體系，獲得再生植株；未見與野豌豆繁殖技術(shù)有關(guān)的文獻。鑒于兩者優(yōu)良的園林應(yīng)用前景，對其繁殖技術(shù)進行了研究。

1 材料與方法

1.1 播 種

1.1.1 材 料

野火球、野豌豆種子于2015年10月10日采自內(nèi)蒙古赤峰巴林右旗。采后自然通風(fēng)干燥，去除種皮后置于牛皮紙袋中低溫保存。

1.1.2 方 法

1) 溫度處理。1%次氯酸鈉溶液滅菌15 min，室溫浸種24 h后，將種子置于10，15，20，25，30，35 ℃恒溫條件下進行發(fā)芽試驗。

2) 赤霉素(GA3)處理。滅菌處理后分別以濃度為125，250，500，1 000 mg/L的GA3溶液浸種24 h，清水沖洗數(shù)次。以室溫浸種作對照(ck)。野火球、野豌豆種子分別放入20，15 ℃恒溫箱中。

3) 浸種處理。滅菌處理后用60，70，80，90 ℃溫水浸種，自然冷卻24 h，以20 ℃清水浸種作為對照(ck)。處理后分別將野火球、野豌豆種子轉(zhuǎn)至20，15 ℃恒溫培養(yǎng)箱中。

4) 濃硫酸處理。滅菌處理后，野火球種子分別用70%硫酸處理1，3，5 min，野豌豆種子分別用70%硫酸處理3，5，10 min沖洗干凈后，用清水浸種24 h，轉(zhuǎn)入20 ℃培養(yǎng)箱中，以20 ℃清水浸種作對照(ck)[7-8]。

將處理后的種子置于鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿中進行發(fā)芽試驗，發(fā)芽過程中滴加蒸餾水。每處理50粒種子，重復(fù)3次。以胚根長與種子等長時統(tǒng)計發(fā)芽率、發(fā)芽勢及發(fā)芽指數(shù)。發(fā)芽試驗期限設(shè)定為35 d。用SPSS(17.0)軟件處理試驗數(shù)據(jù)，對發(fā)芽率、發(fā)芽勢及發(fā)芽指數(shù)利用單因素方差分析進行顯著性檢驗及多重比較。數(shù)值以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

1.2 扦 插

1) 化學(xué)藥劑處理。野火球于2016年7月1日扦插，野豌豆分別于2016年6月30日、8月3日進行2次扦插。將枝條剪成具2節(jié)的插穗，保留1/3～1/2葉片。用1 000倍多菌靈溶液滅菌后，分別用ABT 1#、IAA、IBA、NAA的100，300，500 mg/L溶液處理10 min。以清水處理作對照。每處理10個插穗，重復(fù)3次。

圖1 溫度對種子萌發(fā)的影響

圖2 赤霉素對種子萌發(fā)的影響

圖3 浸種溫度對種子萌發(fā)的影響

2) 扦插基質(zhì)。試驗于2016年6月30日進行，試驗基質(zhì)分別為河沙(A)、珍珠巖(B)、珍珠巖∶蛭石=1∶1(C)、草炭∶河沙=1∶1(D)。插穗剪切及滅菌同1.2項下1)的方法，滅菌后用清水洗凈，野火球直接扦插，野豌豆用100 mg/L ABT 1#溶液處理10 min后扦插。每處理10個插穗，重復(fù)3次。

3) 插后管理與數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。試驗在溫室內(nèi)間歇自動噴霧條件下進行。扦插后，傍晚噴霧停止后每周噴施1次800倍多菌靈溶液，保持插床衛(wèi)生。以插穗出現(xiàn)≥1 mm的不定根為插穗生根的標(biāo)準(zhǔn)[9]。扦插后45 d統(tǒng)計扦插生根率、最長不定根長。數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行方差分析、極差分析、LSD(p≤0.05)多重比較和相關(guān)性分析。分析前，對百分比進行反正弦轉(zhuǎn)換，對生根數(shù)進行平方根轉(zhuǎn)換[10]。

4) 野火球插條解剖結(jié)構(gòu)觀察。取野火球扦插前插條及生根后插條生根部位，徒手切片制作臨時封片，利用Leica光學(xué)顯微鏡觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)處理對種子萌發(fā)的影響

2.1.1 溫度處理

由圖1可知，野火球、野豌豆種子的適宜發(fā)芽溫度范圍分別為15～20 ℃和15～25 ℃。野火球種子以20 ℃溫度下發(fā)芽率最高，為22.00%。野豌豆種子以15 ℃溫度下發(fā)芽率最高，為26.00%，30 ℃以上的高溫顯著抑制種子萌發(fā)。野火球以20 ℃溫度下發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)最高，分別為21.33%、2.31；野豌豆以15 ℃溫度下發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)最高，分別為12.00%、1.95。

2.1.2赤霉素處理

由圖2可知，野火球種子以500 mg/L赤霉素處理時發(fā)芽率、發(fā)芽勢最高，分別為29.33%、23.33%；野豌豆種子以1 000 mg/L赤霉素處理時發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)3項指標(biāo)均為最高，分別為29.33%、15.33%、2.09。

2.1.3 浸種處理

由圖3可知，60～90 ℃浸種能促進野火球種子的萌發(fā)，60～70 ℃浸種時，種子萌發(fā)率顯著高于對照，以70 ℃處理時發(fā)芽率、發(fā)芽勢最高；熱水(90 ℃)浸種可促進野豌豆種子萌發(fā)，以90 ℃處理時野豌豆種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)最高，分別為28%、16.7%、1.99，但除發(fā)芽勢外，其他與對照組無顯著差異。

圖4 硫酸浸種對種子萌發(fā)的影響

表1 激素處理對野火球扦插生根的影響

編號種類濃度(mg/L)生根率(%)生根數(shù)(條)最長根長(cm)1ck—80.00±5.77c6.00±1.36a13.08±1.71abc210083.33±3.33c10.40±1.36a17.28±1.27abcd3ABT1#30076.67±3.33bc11.00±0.71a14.63±2.38abcd450070.00±5.77bc11.60±1.72a10.60±0.74a510073.33±8.82c8.80±0.97a14.00±1.72abcd6NAA30080.00±5.77c9.40±1.69a18.95±1.74cd750060.00±5.77b12.60±2.16a19.03±2.78d810073.33±3.33bc8.00±1.97a12.10±0.84ab9IAA30076.67±3.33bc8.80±2.96a12.83±2.53ab1050060.00±5.77b7.00±1.67a9.10±1.74a1110070.00±5.77bc7.00±1.22a13.60±1.17abcd12IBA30076.67±3.33bc9.80±1.77a13.98±1.02abcd1350013.33±3.33a8.25±1.70a11.00±0.52a

注：同列不同小寫字母表示p≤0.05水平差異顯著。下同。

2.1.4 硫酸浸種處理

由圖4可知，硫酸(70%)浸種會破壞野火球、野豌豆的外種皮，隨浸種處理時間延長，種子霉?fàn)€率增加，直接影響了兩者的萌發(fā)率。

2.2 扦插前處理對扦插生根的影響及扦插生根解剖學(xué)觀察結(jié)果

2.2.1 化學(xué)藥劑處理

1) 野火球。扦插后約10 d開始生根。如表1、表2所示，藥劑種類對野火球生根率和最大根長影響顯著(0.01≤p≤0.05或p≤0.01)，濃度僅對野火球生根率影響顯著。

100 mg/L ABT 1#處理的野火球插穗生根率最高，為83.33%，但與對照生根率(80.00%)差異不顯著，其余處理的生根率等于或低于對照，500 mg/L的IBA處理的插穗生根率最低，僅為13.33%，與其他處理存在顯著性差異。

對不同藥劑種類及不同濃度的多重比較結(jié)果(表3)表明，激素處理降低了野火球生根率，ABT 1#和NAA的使用可增加最大根長。

2) 野豌豆。扦插后約25 d開始生根。如表4、表5所示，藥劑濃度對野豌豆扦插的生根數(shù)有顯著的影響，藥劑種類對其扦插生根無顯著性差異。6月末，用100 m/L的NAA或300 mg/L的IBA處理插穗生根率最高，為13.33%。8月初用ABT 1#或IBA 300 mg/L為最佳處理，生根率分別為63.33%和60%。

表2 化學(xué)藥劑處理對野火球扦插生根影響的方差分析

差異來源F值生根率生根數(shù)最長根長種類3.244*0.6884.631**濃度13.995*0.3761.037

注：“*”表示在p≤0.05水平差異顯著，“**”表示在p≤0.01水平差異顯著。下同。

2.2.2 基 質(zhì)

野火球在A、C、D基質(zhì)中第12天開始生根，B基質(zhì)中第14天開始生根；野豌豆在4種基質(zhì)中的生根時間均在25 d左右。由表6可知，2種插穗在珍珠巖∶蛭石=1∶1中扦插生根率最高，分別為93.33%、50%。

2.2.3 扦插生根解剖學(xué)觀察

1) 生根類型及外部形態(tài)觀察。野火球、野豌豆兼有皮部生根及愈傷組織生根，但以皮部生根較多。扦插后，野火球插條先有少量愈傷組織形成，之后由愈傷組織及插穗皮部生出不定根，皮部不定根為主要生根類型(圖5)；野豌豆有少量插穗形成愈傷組織，并且有根從愈傷組織長出，但多數(shù)根是直接由插穗的皮部長出(圖6左)。

表3 化學(xué)藥劑種類及濃度的多重比較

種類生根率(%)最長根長(cm)濃度(mg/L)生根率(%)ck80.00b13.53ab080.00bABT1#76.25b14.38ab10075.45bNAA71.11ab18.37b30077.50bIAA70.00ab11.31a50052.00aIBA57.14a12.47ab

2) 野火球插穗解剖構(gòu)造。從半木質(zhì)化插穗莖由外至內(nèi)分別由表皮、皮層、韌皮部、形成層、木質(zhì)部、髓組成(圖6左)插穗最外層是一層緊密排列、性狀規(guī)則的表皮細(xì)胞。表皮之內(nèi)是排列疏松、有明顯細(xì)胞間隙的薄壁細(xì)胞組成的皮層，靠近表皮的皮層細(xì)胞存在厚角組織，這些厚角組織及其附近的薄壁細(xì)胞中含有葉綠體，使幼莖呈現(xiàn)綠色。皮層與維管柱之間無明顯界限。維管柱中維管束排列相近，由髓射線薄壁細(xì)胞恢復(fù)分裂能力形成的束間形成層相連。維管束由外向內(nèi)依次是韌皮部、形成層和木質(zhì)部。髓在莖的橫切中心，由具有儲藏功能的薄壁細(xì)胞組成。在莖的橫切面結(jié)構(gòu)中沒有發(fā)現(xiàn)潛伏根原基，說明母株在正常生長過程中沒有根原基存在。

表4 化學(xué)藥劑處理對野豌豆扦插生根的影響

種類濃度(mg/L) 6月30日扦插 8月3日扦插 生根率(%)生根數(shù)(條)最長根長(cm)生根率(%)生根數(shù)(條)最長根長(cm)ck————10.00abc3.33abc4.00ab1003.33a2.00ab0.30a40.00ef7.33de7.37abcABT1#3006.67ab5.00bc6.25cde60.00gh6.67cd15.33e5003.33a7.00c8.50f33.33de13.00f10.37bcde10013.33b4.00abc5.90cd40.00ef8.33de9.23abcdeNAA30010.00ab4.67ba4.37bc46.67efg10.33ef8.40abcd5006.67ab1.00a8.05ef13.33abc7.00de4.27ab100———6.67ab3.00ab3.20aIAA3006.67ab7.00c3.50b23.33cd5.67bcd4.27ab5003.33a4.00abc6.70def20.00bcd7.67de8.67abcde1006.67ab6.00c5.80cd50.00fgh9.00de13.90cdeIBA30013.33b10.33d3.70b63.33h10.33ef15.07de500———3.33a2.00a3.50a

注：a為野火球 ，b～c為野豌豆(b.愈傷組織生根；c.皮部生根)。圖5 插穗生根外部形態(tài)

注：A為表皮，B為皮層，C為韌皮部，D為形成層，E為木質(zhì)部，F(xiàn)為髓，G為髓射線，H為導(dǎo)管，I為分裂加寬的形成層，J為根原基細(xì)胞。圖6 插穗生根前橫切解剖結(jié)構(gòu)(左) 插穗生根后根原始細(xì)胞橫切解剖結(jié)構(gòu)(右)

3) 不定根的形成過程。從解剖觀察可知，插穗切口上方的莖中維管形成層、韌皮部的薄壁細(xì)胞恢復(fù)分裂能力，出現(xiàn)加厚的形成層，同時，髓射線薄壁細(xì)胞恢復(fù)分裂能力的形成束間形成層逐漸與束中形成層相連形成一個完整的維管形成層(圖6右)，并由維管形成層的位置分裂出一些成團的與周圍細(xì)胞明顯不同的薄壁細(xì)胞。這些細(xì)胞大小排列緊密，體積較小，細(xì)胞質(zhì)較濃，這些成團的細(xì)胞形成了根原基(圖6右)。隨著根原基細(xì)胞的不斷向外分裂分化，穿入皮層，最終完成不定根的生長發(fā)育過程。

3 結(jié) 論

3.1野火球種子70 ℃浸種至自然冷卻24 h后于20 ℃萌發(fā)最有利于其存活。赤霉素預(yù)處理效果不及溫水浸種，且浸種處理操作更簡便易行。ABT 1#、NAA處理能促進野火球扦插生根后根系長度的伸長生長，7月初100 mg/L ABT 1#處理插穗10 min后扦插于珍珠巖∶蛭石=1∶1混合基質(zhì)中，生根率較高。

3.2赤霉素預(yù)處理與浸種處理對野豌豆種子萌發(fā)的促進作用均不明顯。故20 ℃浸種處理后于15 ℃萌發(fā)，由于其操作簡便成本低，更利于其規(guī)?；敝?。8月初用ABT 1#或IBA 300 mg/L處理野豌豆插穗10 min后插于珍珠巖∶蛭石1∶1的混合基質(zhì)中，是較高效快捷的繁殖方式。

表5 化學(xué)藥劑處理對野豌豆扦插生根影響的方差分析

差異來源 6月30日扦插F值 8月3日扦插F值 生根率生根數(shù)最長根長生根率生根數(shù)最長根長種類0.1280.6160.0810.1250.7070.241濃度0.0830.008**0.1090.000**0.180 0.084

表6 基質(zhì)對扦插生根的影響

種類生根率(%)野火球野豌豆A73.33±3.33a13.33±3.34aB76.67±6.67ab20.00±5.77aC93.33±3.33b50.00±5.77bD80.00±5.77ab10.00±0.00a

3.3野火球、野豌豆兼具愈傷組織生根和皮部生根，但皮部生根為主。野火球枝條內(nèi)沒有潛伏的根原基，扦插形成的不定根起源于誘生根原基。誘生根原基發(fā)源于形成層。野豌豆扦插不定根的起源尚待進一步研究。