3種新型納米粉末顯現(xiàn)對(duì)潛指印中DNA分型的影響

喻彥林， 王旭東， 顏 磊

(1.西南政法大學(xué)刑事偵查學(xué)院， 重慶 401120； 2.重慶高校物證技術(shù)工程研究中心， 重慶 401120)

0 引言

指印歷來被稱為“證據(jù)之王”。刑事現(xiàn)場遺留的指印多為潛指印。粉末顯現(xiàn)法操作簡便、價(jià)格低廉、顯現(xiàn)效果好，廣泛適用于在光滑表面的潛指印的顯現(xiàn)中，至今仍是刑事現(xiàn)場潛指印顯現(xiàn)最為常用的方法之一。但由于傳統(tǒng)顯現(xiàn)粉末(如金粉、銀粉、碳粉、磁粉等)的尺寸多為微米級(jí)，對(duì)于滲透性客體、粗糙表面則顯現(xiàn)效果通常較差。隨著納米材料和納米技術(shù)的不斷發(fā)展，具有均一、超微尺寸的功能化納米材料在潛指印的顯現(xiàn)中受到了越來越多的關(guān)注[1]。CdTe量子點(diǎn)[2]、金屬納米顆粒(Au、Ag、Pt)[3-5]、碳點(diǎn)[6]等納米材料[7-8]均已應(yīng)用于潛指印的顯現(xiàn)中。這些納米材料顯現(xiàn)不僅可以顯現(xiàn)清晰的指印一級(jí)特征、二級(jí)特征，而且可清晰顯現(xiàn)指印的三級(jí)特征；尤其是對(duì)于粗糙表面上的潛指印，其顯現(xiàn)效果顯著優(yōu)于傳統(tǒng)粉末的顯現(xiàn)效果，已經(jīng)獲得了商品化應(yīng)用。

DNA分析是目前刑事技術(shù)中個(gè)體認(rèn)定最為強(qiáng)有力的工具之一。隨著DNA的高靈敏提取技術(shù)的發(fā)展，指印接觸DNA(Touch-DNA)分型成功率大幅提高，尤其是對(duì)于現(xiàn)場模糊指印，DNA分析在遺留人認(rèn)定中具有決定性的作用，已成為近年來刑事現(xiàn)場的應(yīng)用熱點(diǎn)。

刑事現(xiàn)場潛指印的顯現(xiàn)過程是否影響后續(xù)DNA分型？研究表明，化學(xué)顯現(xiàn)方法對(duì)指印DNA分型存在不同程度影響; 而通常認(rèn)為粉末法等物理顯現(xiàn)方法對(duì)指印物質(zhì)、指印載體損害較小，有利于后續(xù)的DNA分型[9]。但由于納米材料具有不同于常規(guī)粉末的獨(dú)特理化性質(zhì)，新型納米粉末顯現(xiàn)指印對(duì)DNA分型的影響尚待進(jìn)一步研究。

本研究組先后發(fā)展了基于微波輻射的快速制備Fe3O4磁性納米粉末[10]、金納米- 蒙脫土復(fù)合熒光粉末[11-12]、碳量子點(diǎn)- 蒙脫土復(fù)合熒光粉末[6]的納米粉末/復(fù)合物，均具備簡便快捷、環(huán)境友好、對(duì)人體無害、有強(qiáng)烈熒光/磁性等功能性優(yōu)勢(shì)，應(yīng)用于多種載體上潛指印的顯現(xiàn)，取得了理想效果。本文詳細(xì)考察了上述3種不同納米粉末顯現(xiàn)前后對(duì)指印中殘留DNA分析的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 納米粉末的制備

實(shí)驗(yàn)中所用的納米及其復(fù)合物粉末均為自制。Fe3O4磁性納米粉末制備的簡要步驟如下[10]：取0.278 g FeSO4·7H2O溶解于50.0 mL超純水中，濃氨水調(diào)節(jié)pH值為11.0后，置于微波高火加熱數(shù)分鐘，永磁體作用下分離、收集沉淀并水洗至中性，真空干燥后備用。制備的Fe3O4的典型尺寸為80 nm，具備明顯磁性。

碳量子點(diǎn)(CD)熒光粉末制備[6]：稱取2.0 g檸檬酸和0.2 g L-半胱氨酸，溶于10 mL超純水，微波爐中高火微波加熱5 min。將產(chǎn)物加入5 mL超純水溶解，得到黃色透明的溶液。取上述溶液1.0 mL，加入0.25 g蒙脫土，混勻后在室溫靜置2 h。離心除去清液后烘干沉淀，即得到具有強(qiáng)烈熒光的碳量子點(diǎn)- 蒙脫土納米復(fù)合物。

金納米團(tuán)簇(AuNC)熒光粉末制備[11]：在1.0 mL 10 mmol/L氯金酸溶液中依次加入1.0 mL 65mg/L BSA溶液、0.1 mL 1.0 mol/L氫氧化鈉溶液，混合均勻后置于聚四氟乙烯的高壓消解罐中，微波30 s，得到深棕色、具有強(qiáng)烈紅色熒光的溶液。在上述產(chǎn)物中加入0.25 g蒙脫土，混勻后磁力攪拌0.5 h，離心除去清液，真空干燥沉淀，即得到具有強(qiáng)烈紅色熒光的金納米團(tuán)簇- 蒙脫土納米復(fù)合物。

1.2 潛指印的遺留與顯現(xiàn)

所有用于提取指印中DNA的材料均經(jīng)過清洗與消毒。載玻片(帆船牌，76 mm×25 mm，厚度1.0～1.2 mm)依次采用洗滌劑、超純水、乙醇清洗后自然晾干，并紫外消毒30 min。鑷子、剪刀均經(jīng)紫外消毒。

3名志愿者(2男1女)均在肥皂洗手后一小時(shí)提取指印。捺印前摩擦左右手以減少左右手差異，分別以左右手拇指、食指、中指、環(huán)指分別在不同載玻片上輕觸遺留指印。每名自愿者遺留20枚指印，其中15枚(每組5枚)采用制備的3種納米粉末顯現(xiàn)指印后提取DNA，5枚未經(jīng)顯現(xiàn)直接提取DNA(對(duì)照組)，另取未遺留指印的載玻片作為空白對(duì)照。為避免指印顯現(xiàn)過程中指紋刷可能帶來污染[13]，采用“抖顯法”進(jìn)行顯現(xiàn)。

1.3 DNA提取

采用“生物物證提取專用棉簽”(北京佰優(yōu)意諾科技有限公司)蘸取無菌水擦拭指印(或空白對(duì)照)后，采用D-盾超敏DNA提取試劑盒(II型，上?；菸纳锛夹g(shù)有限公司)并按照試劑盒操作說明進(jìn)行提取。主要步驟如下：1)將擦拭后的棉簽拭子轉(zhuǎn)移入離心套管，加入裂解液160 μL，56 ℃裂解25 min，99 ℃裂解10 min；2)13 000 g離心10 s，加入吸附液200 μL，13 000 g離心(eppendorf 5415D)2 min，除去套管后加入吸附液950 μL，混勻后加入吸附珠16 μL，靜止15 min；3)8 000 g離心30 s，除去上清液，加入漂洗液750 μL，混勻；4)8 000 g離心30 s，除去漂洗液，56 ℃烘干吸附珠；5)加入漂洗液30，混勻，56 ℃溫育15 min后備檢。

1.4 PCR擴(kuò)增與電泳分析

采用GeneAmp PCR System 9700(AB公司，美國)擴(kuò)增儀和STRtyper-21G Plus復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng) (海爾施,寧波)進(jìn)行擴(kuò)增；反應(yīng)體系為25 μL。反應(yīng)條件為95 ℃11 min; 94 ℃20 s, 59 ℃3 min,共30個(gè)循環(huán); 60 ℃10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用ABI 3500型基因分析儀(AB公司, 美國)進(jìn)行毛細(xì)管電泳,用Gene Mappe ID-X軟件(AB公司, 美國)分析STR基因型。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析采用Graphpad Prism 6.0(Graphpad Sofrware，美國)進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 分型結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，空白對(duì)照中未檢出DNA，表明實(shí)驗(yàn)區(qū)域未受污染。指印提取物的典型電泳譜圖見圖1。由于DNA含量低，多數(shù)指印未能對(duì)所有基因座準(zhǔn)確分型，部分等位基因出現(xiàn)了明顯的不對(duì)稱擴(kuò)增。

為了考察不同粉末顯現(xiàn)對(duì)DNA分型的影響，本實(shí)驗(yàn)共對(duì)3名志愿者遺留的60枚指印中DNA進(jìn)行了分型，分型結(jié)果見圖2。實(shí)驗(yàn)中的3個(gè)空白對(duì)照中均未檢出DNA，表明實(shí)驗(yàn)區(qū)域未受污染；志愿者1所留的各組指印中均檢出DNA，檢出位點(diǎn)數(shù)均高于15個(gè)；而志愿者2所留指印中DNA分型成功率較低，僅11枚顯現(xiàn)后的指印中檢出11個(gè)以上的基因座；志愿者3所留的15枚指印中的14枚檢出11個(gè)以上的基因座。3名志愿者之間指印中位點(diǎn)檢出率差異明顯，體現(xiàn)了個(gè)體差異的顯著影響[14-15]。

圖1 顯現(xiàn)后指印中提取的DNA的典型電泳圖

2.2 不同顯現(xiàn)方法對(duì)STR分型結(jié)果的影響

由圖2可知，同一志愿者遺留的指印中，對(duì)照組(未顯現(xiàn)組)與Fe3O4顯現(xiàn)組、CD顯現(xiàn)組、AuNC顯現(xiàn)組無明顯差異。為了進(jìn)一步定量評(píng)估顯現(xiàn)組與對(duì)照組差異的顯著性，本文采用t檢驗(yàn)方法(Student’st-test，表1進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，所有顯現(xiàn)組與對(duì)應(yīng)對(duì)照組的P值均遠(yuǎn)大于0.05，表明所有顯現(xiàn)組與未顯現(xiàn)組STR分型成功率均無顯著差異。

Fe3O4納米粉末、Au-NCs@MMT、C-Dots@MMT顯現(xiàn)潛指印的原理均為與指印物質(zhì)的靜電相互作用，其顯現(xiàn)過程與指印殘留物未發(fā)生化學(xué)鍵合；上述3種粉末中的納米材料及蒙脫土載體均為環(huán)境友好試劑，不會(huì)導(dǎo)致指印中的DNA降解。本實(shí)驗(yàn)采取的DNA提取方法基于吸附珠對(duì)DNA的選擇性結(jié)合，F(xiàn)e3O4粉末、蒙脫土難以溶于水，Au-NCs、C-Dots與吸附珠無明顯特異性結(jié)合，在清洗過程中也已有效去除。因此，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)的所有顯現(xiàn)組與控制組基因座檢出率均無顯著差異，是合理的。上述結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的對(duì)其他物理顯現(xiàn)方法及部分化學(xué)顯現(xiàn)方法的評(píng)價(jià)結(jié)果一致[7]。

圖2 納米粉末顯現(xiàn)組與對(duì)照組檢出位點(diǎn)數(shù)比較

DonorP value (vs Untreated)Fe3O4Au-NCsC-Dots10.5573>0.99990.346620.62060.78850.928030.88500.87430.8062

3 結(jié)語

Fe3O4納米粉末、碳量子點(diǎn)、金納米團(tuán)簇及其復(fù)合物不僅無毒無害，而且具有強(qiáng)烈熒光、磁性功能性優(yōu)勢(shì)，用于潛指印顯現(xiàn)，相對(duì)于傳統(tǒng)粉末具有一定優(yōu)越性。本文通過比較Fe3O4納米粉末、碳量子點(diǎn)- 蒙脫土復(fù)合粉末、金納米團(tuán)簇- 蒙脫土復(fù)合粉末3種自制納米粉末顯現(xiàn)的指印與未顯現(xiàn)組指印中DNA提取及分型結(jié)果，發(fā)現(xiàn)3種納米粉末顯現(xiàn)過程對(duì)指印中DNA分型無顯著影響，對(duì)納米粉末在指印顯現(xiàn)中的應(yīng)用具有指導(dǎo)意義。