集菌涂片金胺“O”熒光染色法在檢測痰液中抗酸桿菌的臨床應用

樊曉東 陸興熱 張成偉 張青 資云菊 袁雕 葉樹櫻 王武滿 朱德永 楊生仙 文山州人民醫(yī)院 （云南 文山 663099）

內容提要： 目的：探討金胺“O”熒光集菌染色法在檢測痰液中抗酸桿菌的臨床應用，為肺結核的早期快速診斷、治療提供參考依據(jù)。方法：選擇212例2016年6月～2017年12月感染科收治的疑似肺結核患者為研究對象，對其痰標本采取直接涂片和離心集菌涂片兩種制片方法，用萋-尼氏抗酸染色法和金胺"O"熒光法進行染色鏡檢。結果：直接涂片抗酸染色法陽性率（9.43%，20/212）低于集菌涂片抗酸染色法（13.68%，29/212），直接涂片金胺“O”熒光染色法陽性率（17.45%，37/212）低于集菌涂片金胺“O”熒光染色法（36.32%，77/212），差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=6.62，12.37，P=0.02，0.00）。集菌涂片抗酸染色法陽性率（13.68%，29/212）低于集菌涂片金胺“O”熒光染色法（36.32%，77/212），差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=13.65，P=0.00）。金胺“O”熒光染色法的敏感度，特異性，約登指數(shù)及陽性、陰性預測值均優(yōu)于萋-尼氏抗酸桿菌染色法，差異有顯著性（P＜0.05）。結論：金胺“O”熒光集菌染色法是一種檢測靈敏度高、特異性好、操作簡便、快速的方法，對結核病患者的早期診斷和治療具有重要意義。

結核病大部分就是肺結核，被視為威脅人民群眾身體健康的傳染病?，F(xiàn)如今，我國每年新發(fā)結核病患者就占到了90萬例，作為一個全球30個結核病高負擔國家，在全球占到了第3位[1]。在我國，肺結核病人的診斷中廣泛的應用了痰標本直接涂片法，該路徑價格低廉、操作起來較為簡單。同時也出現(xiàn)了其他的新方法，萋-尼氏抗酸染色法的特點就是陽性檢出率低、鏡檢時間長；金胺“O”熒光染色的特點就是操作方便簡單、極易分辨、時間短等。本研究借助金胺“O”熒光染色法以及抗酸染色法對疑似肺結核患者的痰標本展開檢測，對痰標本中抗酸桿菌進行檢測，對比分析兩種方法的檢測結果，給予臨床應用依據(jù)。

1.材料與方法

1.1 標本來源

212 例標本來源于2016年6月～2017年12月感染科收治的疑似肺結核患者，入組樣本為患者持續(xù)咳嗽、咳痰3周以上，有咯血或伴有血痰；發(fā)熱或胸痛超過2周；胸部X線顯示異常，臨床診斷高度懷疑為肺結核病人的晨痰標本。合格痰標本應為血性、膿性、干酪樣及黏液性痰，標本量≥2mL。其中男49例，女45例，年齡20～67歲，平均（45.9±12.3）歲。每份痰標本制備4張?zhí)低科?，其?張為直接痰涂片，2張為次氯酸鈉液化離心沉淀集菌痰涂片。分為抗酸染色組和熒光染色組，每組由1張直接痰涂片和1張集菌痰涂片組成。

1.2 儀器與試劑

金胺“O”熒光染色液、萋-尼氏抗酸染液由珠海貝索生物技術有限公司提供、生物顯微鏡、日本奧林巴斯熒光顯微鏡、上海復星生物安全柜、清潔無油脂新玻片。

1.3 方法

借助竹簽，將痰標本中膿樣、干酪樣或者血性挑取部分，大約0.05～0.1mL，在玻片正面右側2/3中央處，均勻涂抹成痰膜朝上、厚薄適中的一個10mm×20mm的卵圓形痰膜，在生物安全柜中靜置，打開紫外線燈照射15min（滅菌），室溫下干燥后將痰涂片火焰固定。將剩余痰標本加等體積的5%次氯酸鈉溶液，混勻后靜置30min（液化、滅菌）[2]，倒入潔凈離心試管中，震蕩混勻后用離心機4000r/轉離心15min[3]，去上清，留1mL沉渣混勻制成2張集菌痰涂片，涂片方法同直接涂片法。剩余沉渣保留備用。將制備好的痰涂片進行染色和鏡檢。①染色方法：染色嚴格按照試劑盒操作說明進行。抗酸染色組：將已固定的痰涂片滴加石碳酸復紅溶液初染10min；水洗，瀝水后滴加酸性酒精脫色1～2min或至無色；水洗，瀝水后滴加亞甲基藍溶液復染30s，水洗，晾干待檢。熒光染色組：涂片固定后加金胺“O”染色液室溫初染15min，水洗，瀝水后用酸性酒精脫色1～2min或至無色，水洗，瀝水后用高錳酸鉀復染液復染3min，水洗晾干待檢；②鏡檢：抗酸染色組：染色好的痰涂片用OLYMPUS CX21普通光學顯微鏡觀察。用40×物鏡觀察細胞形態(tài)，使用100×油鏡觀察細菌細胞形態(tài)，每個標本仔細觀察300個視野。熒光染色組：已染好的痰涂片用OLYMPUS熒光落射暗視野顯微鏡觀察，鏡檢使用的是10×目鏡、20×物鏡，若是出現(xiàn)疑為抗酸桿菌的熒光桿狀的物質，借助40×物鏡展開確認。需要依據(jù)《中國結核病防治規(guī)劃·痰涂片鏡檢標準化操作及質量保證手冊》來確保涂片鏡檢的質量，同時依據(jù)相關的程序和頻度來實施[4]。痰涂片保存需要超過1年，以便上級結核病實驗室展開接下來的質量控制復驗?？顾釛U菌陽性：抗酸桿菌陽性（1+）：3～9條/100視野；抗酸桿菌菌數(shù)1～8條/300視野；抗酸桿菌陽性（2+）：1～9條/10視野；抗酸桿菌陽性（3+）：1～9條/1視野；抗酸桿菌陽性（4+）：≥10條/1視野。報告1+時至少觀察300個視野，報告2+至少觀察100個視野，3+、4+時至少觀察50個視野。萋-尼氏抗酸桿菌染色鏡檢結果分級標準：萋-尼氏染色抗酸桿菌陰性：對300個不同視野進行連續(xù)觀察，沒有出現(xiàn)抗酸桿菌；熒光染色鏡檢結果分級報告標準：熒光染色抗酸桿菌陰性（-）：0條/50視野；熒光染色抗酸桿菌陽性（報告抗酸桿菌數(shù)）：1～9條/50視野；熒光染色抗酸桿菌陽性（3+）：10～99條/1視野；熒光染色抗酸桿菌陽性（4+）：100條及以上/1視野；熒光染色抗酸桿菌陽性（2+）：1～9條/1視野；熒光染色抗酸桿菌陽性（1+）：10～49條/50視野。報告2+至少觀察50個視野，3+及以上的陽性結果至少觀察20個視野。

表1. 集菌涂片抗酸染色法法及金胺“O”熒光染色法三維卡方檢驗

1.4 統(tǒng)計學分析

按照萋-尼氏抗酸桿菌染色和熒光染色鏡檢結果分級標準，比較兩種方法檢出的陽性例數(shù)，對比萋-尼氏抗酸染色法以及金胺“O”熒光染色檢查的假陽性率、假陰性率、靈敏度、特異性、準確度，并計算一致性系數(shù)。采用SPSS20.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計數(shù)資料以（n，%）表示并予以χ2檢驗，及χ2分割檢驗（P＜0.05時具有統(tǒng)計學差異）進行兩兩比較，對兩種方法的診斷結果進行比較（配對卡方檢驗之三維配對卡方檢驗），P＜0.05則視為差異有統(tǒng)計學意義。

2.結果

2.1 對比兩種染色方法檢測結果

金胺“O”熒光染色后，分枝桿菌在熒光顯微鏡下發(fā)出橘黃顏色，高倍鏡（物鏡40倍目鏡10倍）下，能夠看到分枝桿菌出現(xiàn)黃綠色熒光，呈現(xiàn)出分枝狀或者桿狀?？顾崛旧螅诘{色背景下，抗酸菌呈紅色，其他細菌和細胞呈藍色，見圖1。212例標本檢測結果表明，直接涂片抗酸染色法陽性率（9.43%，20/212）低于集菌涂片抗酸染色法（13.68%，29/212），直接涂片金胺“O”熒光染色法陽性率（17.45%，37/212）低于集菌涂片金胺“O”熒光染色法（36.32%，77/212），差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=6.62，12.37，P=0.02，0.00），見表1。集菌涂片抗酸染色法陽性率（13.68%，29/212）低于集菌涂片金胺“O”熒光染色法（36.32%，77/212），差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=13.65，P=0.00）。2.2集菌涂片金胺“O”熒光染色、集菌涂片抗酸染色法檢查的診斷效能

金胺“O”熒光染色法的敏感度，特異性，約登指數(shù)及似然比值均優(yōu)于抗酸染色法，差異顯著（P＜0.05），即金胺“O”熒光染色較之于抗酸染色法，優(yōu)勢較大，見表1。

3.討論

對痰標本進行集菌處理被視為一個相對省時又低成本的路徑，能夠有效的強化痰涂片抗酸桿菌鏡檢的靈敏度[5]，本研究對沉渣涂片萋-尼染色兩種方法、直接涂片萋-尼染色、沉渣涂片萋-尼染色和沉渣涂片金銨“O”染色兩類路徑展開彼此的對比，結果顯示集菌涂片法可提高痰標本抗酸桿菌鏡檢的陽性率；把離心集菌涂片法與金銨“O”熒光染色法有機結合，很大程度上進一步強化肺結核痰涂片顯微鏡檢查手段的敏感性，同時大幅度強化工作者的舒適感。通過金胺“O”熒光離心集菌染色法檢測痰中的結核桿菌操作簡單、靈敏度及特異新高，與抗酸染色法對比，能夠顯著提高低含菌量標本的檢出率。