大孔樹(shù)脂分離純化敗醬草黃酮的研究

崔新梅，張海容

（忻州師范學(xué)院生化分析技術(shù)研究所，山西忻州034000）

敗醬草（patrinia），又稱(chēng)澤敗、苦菜等，屬敗醬科多年生草本植物或其近緣植物的帶根全草[1]。生于山坡草地、路旁，中國(guó)各地基本均有分布，是我國(guó)常用中草藥，有清熱解毒，祛瘀排膿等多種功效[1－4]。有關(guān)提取黃酮類(lèi)物質(zhì)方法報(bào)道[5]：有機(jī)溶劑提取法[6]、堿性水或堿性烯醇溶液溶劑提取方法[7]、超臨界流體萃取法[8]、超聲波輔助提取法[9]、微波輔助提取法[10]等。但用這些方法提取的黃酮類(lèi)物質(zhì)純度不高，因此分離純化黃酮類(lèi)物質(zhì)成為生物醫(yī)藥迫切解決的重要路徑。目前，關(guān)于黃酮類(lèi)物質(zhì)分離純化的方法[11]很多，主要有柱層析法、梯度pH值萃取法、鉛鹽沉淀法、高速離心分離法、超濾法。這些方法都存在一些分離純化效果不佳、成本高、有次生危害、污染環(huán)境等問(wèn)題。

大孔樹(shù)脂（macroporous resin）物理化學(xué)穩(wěn)定性高、比表面積大、吸附容量大、選擇性好、吸附速度快、解吸條件溫和、再生處理方便、使用周期長(zhǎng)、宜于構(gòu)成閉路循環(huán)、節(jié)省費(fèi)用等諸多優(yōu)點(diǎn)。大孔吸附樹(shù)脂的使用使中草藥有效單體成分或復(fù)方中某一單體成分的指標(biāo)得到提高[12]。由于大孔樹(shù)脂其本身組成與結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，具有吸附性和篩選性相結(jié)合的分離，純化多種功能，已廣泛應(yīng)用于化學(xué)工業(yè)、制藥和醫(yī)學(xué)衛(wèi)生部門(mén)，特別適用于生物化學(xué)制品、天然產(chǎn)物的分離純化、藥物制備等各個(gè)領(lǐng)域，具有良好的應(yīng)用前景。

本文研究9種大孔樹(shù)脂對(duì)敗醬草黃酮吸附和解吸性能。并考察對(duì)敗醬草黃酮的靜態(tài)、動(dòng)態(tài)吸附和解吸性能及其主要影響因素，對(duì)相關(guān)的吸附動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)、吸附等溫線(xiàn)以及動(dòng)態(tài)吸附、解吸曲線(xiàn)等進(jìn)行詳細(xì)的研究，得到適宜的敗醬草黃酮純化條件及生產(chǎn)黃酮化合物工藝的理論模型。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

敗醬草：產(chǎn)地忻州，采集于2013年6月，經(jīng)忻州師范學(xué)院生物系李志英教授鑒定為敗醬科、敗醬屬多年生草本植物（Patrinia scabiosaefolia Fisch.ex Trev）干燥全株；H103、NKA、NKA－9、NKA－Ⅱ、D4006、AB－8、S－8、D4020、X－5 型大孔樹(shù)脂：南開(kāi)大學(xué)生產(chǎn)廠；水：純凈水；95%乙醇（分析純）：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；鹽酸（36%～38%）、Al（NO3）3·9H2O（分析純）：北京化工廠；氫氧化鈉、無(wú)水槲皮素（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

KQ－400KDE型高功率超聲儀：昆山市超生儀器有限公司；AB204－N型分析天平：上海澤生科技開(kāi)發(fā)有限公司；L6紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；SHZ－D（Ⅲ）型循環(huán)水真空泵：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；TDL－40B離心機(jī)：金壇市友聯(lián)儀器研究所；DKZ－450B電熱恒溫振蕩水槽：江蘇省金壇市杰瑞爾電器有限公司；層析柱（Φ1.0×40）：上海精科實(shí)業(yè)有限公司；DHL－200電腦恒流泵：上海精科實(shí)業(yè)有限公司；RE－2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化廠。

1.2 方法

1.2.1 敗醬草粗提取液的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)量5.0 g的敗醬草粉末，分別加入20倍體積的40%的乙醇溶液，在60℃、時(shí)間45 min、功率100 W情況下超聲波萃取[8]。后進(jìn)行抽濾，過(guò)濾2次，定容到100 mL容量瓶中備用。

1.2.2 黃酮測(cè)定及工作曲線(xiàn)

用移液管準(zhǔn)確移取 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 mL 0.1 mg/mL槲皮素標(biāo)準(zhǔn)液于10個(gè)25 mL比色管中，各加入1.0 mL 5%的Al（NO3）3溶液，用95%乙醇定容，搖勻，靜置。并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。以吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，濃度C（μg/mL）為橫坐標(biāo)，在吸收波長(zhǎng)為510 nm處，得回歸方程：A=0.074C+0.006 9，相關(guān)系數(shù)：R2=0.999 5。

1.2.3 大孔樹(shù)脂的預(yù)處理

將10種大孔樹(shù)脂分別用95%乙醇在室溫密封下浸泡24 h，然后抽濾，用蒸餾水沖洗至流出液無(wú)醇味；用5%鹽酸浸泡3 h～4 h，然后抽濾，用蒸餾水洗至中性；再用5%氫氧化鈉溶液浸泡3 h～4 h，抽濾，用蒸餾水洗至中性后室溫晾干，備用[13]。

1.2.4 純度、回收率

純度、回收率計(jì)算按文獻(xiàn)[14]方法計(jì)算。

1.2.5 大孔樹(shù)脂篩選方法

9種大孔樹(shù)脂各2.0 g，分別裝入100 mL的錐形瓶中，并加入20.0 mL的敗醬草粗提取液，水浴振蕩24 h（25℃），抽濾，離心，測(cè)定溶液中剩余黃酮濃度C1（mg/mL）。式中：C0為吸附前敗醬草粗提取液黃酮濃度，mg/mL；V為吸附溶液體積，mL；m為樹(shù)脂質(zhì)量，g。根據(jù)公式（1）、（2）計(jì)算吸附量 Q（mg/g）和吸附率（%）。同理，將中充分吸附24 h的樹(shù)脂，用少量蒸餾水洗滌，轉(zhuǎn)移到100 mL錐形瓶中，加入95%的乙醇20.0 mL，置于恒溫水浴振蕩器中，振蕩24 h（25℃），測(cè)定吸附液中黃酮的濃度C2（mg/mL）。根據(jù)公式（3）計(jì)算解吸率（%）。

1.2.6 大孔樹(shù)脂純化敗醬草黃酮優(yōu)化設(shè)計(jì)

在考察單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇影響大孔樹(shù)脂純化敗醬草黃酮的幾個(gè)主要因素：吸附速率、洗脫速率、pH值、乙醇體積分?jǐn)?shù)（洗脫液）按表1設(shè)計(jì)進(jìn)行正交試驗(yàn)。

表1 大孔樹(shù)脂純化敗醬草黃酮工藝正交試驗(yàn)因素及水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test for purification of flavonoids from patrinia with macroporous resin

2 結(jié)果與討論

2.1 大孔樹(shù)脂篩選

用 H103、NKA、NKA-9、NKA-Ⅱ、D4006、AB-8、S-8、D4020、X-5這9種預(yù)處理過(guò)的樹(shù)脂，進(jìn)行敗醬草黃酮的靜態(tài)吸附試驗(yàn)[14]。在相同試驗(yàn)條件下，測(cè)得各樹(shù)脂對(duì)敗醬草黃酮的靜態(tài)吸附、解吸結(jié)果如表2所示。

表2 不同類(lèi)型樹(shù)脂對(duì)敗醬草黃酮的吸附、解吸情況比較Table 2 Comparison of adsorption and desorption of different types of resin to patrinia flavonoids

由表2可見(jiàn)在這9種樹(shù)脂中對(duì)敗醬草黃酮吸附量和吸附率最大的是S-8樹(shù)脂，吸附量是1.112 mg/g，吸附率是95.91%；其次是AB-8和H103樹(shù)脂，吸附量分別是1.069 mg/g和0.812 mg/g，吸附率分別是87.69%和66.62%；NKA-Ⅱ樹(shù)脂對(duì)敗醬草黃酮吸附量和吸附率最小。

從樹(shù)脂方面看，樹(shù)脂的骨架結(jié)構(gòu)、極性（功能基）、比表面積和平均孔徑是影響樹(shù)脂吸附的重要參數(shù)[15-16]。在樹(shù)脂吸附過(guò)程中，極性稍強(qiáng)的樹(shù)脂對(duì)極性強(qiáng)的分子有較強(qiáng)的吸附作用，試驗(yàn)中的敗醬草黃酮因具有酚羥基而具有極性，S-8樹(shù)脂屬極性樹(shù)脂，故S-8對(duì)敗醬草黃酮的吸附性能相對(duì)較好。從表1可以看出，靜態(tài)吸附較好的樹(shù)脂中除S-8外，95%的乙醇都能很好的洗脫AB-8和H103樹(shù)脂上吸附的敗醬草黃酮。雖然S-8樹(shù)脂的吸附能力強(qiáng)，但其洗脫率太低，終選用AB-8樹(shù)脂吸附分離敗醬草黃酮。

2.2 泄露曲線(xiàn)

將300 mL敗醬草粗提液以1.0 mL/min的流速進(jìn)樣，加入AB-8樹(shù)脂柱中，以1mL/min的流速通過(guò)，分段收集流出液，測(cè)定并計(jì)算每段流出液的黃酮的濃度，動(dòng)態(tài)泄露曲線(xiàn)如圖1所示。

圖1 AB-8樹(shù)脂吸附敗醬草黃酮泄露曲線(xiàn)Fig.1 Leak curve of AB-8 resin adsorption patrinia flavanoids

從圖1可以看出，隨進(jìn)樣液體積增加，流出液中黃酮含量的增加，當(dāng)進(jìn)樣量體積達(dá)到210 mL后，流出液中黃酮含量與進(jìn)樣液中含量基本保持不變，此時(shí)樹(shù)脂的吸附量已經(jīng)達(dá)到飽和。用AB-8樹(shù)脂吸附敗醬草黃酮選擇最大進(jìn)樣量為210 mL。

2.3 上樣速率考察

取5份的粗提取液，分別加入5根AB-8樹(shù)脂柱中，以 0.5、1.0、1.5、3、4.5 mL/min 的流速通過(guò)，收集各自流出液，測(cè)定并計(jì)算黃酮吸附量，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 流速對(duì)AB-8吸附敗醬草黃酮影響Fig.2 Effect of flow rate on AB-8 adsorption patrinia flavonoids

由圖2可以看出，5種流速叢0.5 mL/min已經(jīng)有較好的吸附效果。這是因?yàn)樯现魉龠^(guò)快，敗醬草黃酮溶液跟樹(shù)脂平衡的時(shí)間短，黃酮分子來(lái)不及擴(kuò)散到樹(shù)脂的內(nèi)表面從而導(dǎo)致瀉漏過(guò)，使得黃酮吸附降低。流速慢，黃酮分子有充足的時(shí)間與樹(shù)脂的內(nèi)表面接觸，增加對(duì)黃酮的吸附，從而提高吸附情況?？紤]實(shí)際操作效率，選擇上樣流速為1.0 mL/min。

2.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)靜態(tài)解吸的影響

試驗(yàn)采用乙醇作為洗脫劑，主要是考慮到敗醬草黃酮易溶于乙醇，且乙醇毒性小，適合天然藥物有效成分的提取分離。選用20%、40%、60%、80%、95%這5種不同濃度的乙醇洗脫劑，比較解吸率，結(jié)果如表3所示。

表3 乙醇濃度對(duì)敗醬草黃酮洗脫解吸率的影響Table 3 Effect of ethanol concentration on the elution desorption rate of patrinia flavonoids

隨著乙醇濃度從20%到60%的增加，敗醬草黃酮解吸率也增大；乙醇濃度超過(guò)60%時(shí)，敗醬草黃酮解吸率反而減小，故選擇60%的乙醇洗脫敗醬草黃酮較適宜。

2.5 洗脫液pH值對(duì)解吸的影響

用60%乙醇溶液洗脫，洗脫速率為1.0 mL/min，用三酸緩沖液調(diào)節(jié) pH值分別為 2.15、3.30、4.56、6.14、7.50、9.01、11.2，收集洗脫液，計(jì)算洗脫率分別為 35.2%、72.4%、74.9%、75.3%、76.8%、58.0%、43.1%。試驗(yàn)表明，pH值對(duì)洗脫率影響較大，在酸性范圍內(nèi)，敗醬草黃酮洗脫率較高，pH值增大（pH﹥7.50）洗脫率隨pH值增大而顯著下降。上述情況與文獻(xiàn)報(bào)道[17]一致，即黃酮類(lèi)物質(zhì)的酚羥基，在酸性條件下以分子狀態(tài)存在，主要以范德華力與樹(shù)脂吸附作用；溶液pH值增大為堿性時(shí)，酚羥基離子化，與樹(shù)脂間的分子間力下降，因此選pH 7.50。

2.6 洗脫速率的影響

取4份50mL的敗醬草粗提取液，分別加入4根填充AB-8樹(shù)脂柱，在pH 6.14條件下，分別用0.5、1.0、2.5、4.5 mL/min進(jìn)行洗脫，收集各自流出液，考察洗脫速率對(duì)洗脫效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 洗脫速率對(duì)解吸率的影響Fig.3 Effect of elution rate on desorption rate

由圖3可得，洗脫速率對(duì)洗脫效果有明顯影響。洗脫速率與對(duì)解吸率兩者成反比關(guān)系。流速1.0 mL/min時(shí)，解吸率最高。隨著解吸速率的增加，解吸率呈下降趨勢(shì)。結(jié)果表明，在進(jìn)行解吸試驗(yàn)時(shí)，速度越慢解吸效果越好，可能是因?yàn)榱魉偬?，洗脫劑未能與被吸附的黃酮進(jìn)行充分作用而將其從大孔樹(shù)脂的吸附位點(diǎn)上置換出。但流速過(guò)低，洗脫時(shí)間較長(zhǎng)，考慮生產(chǎn)成本與效率，選擇1.0 mL/min作為洗脫速率。

2.7 洗脫劑用量考察

取敗醬草黃酮粗提取液，加入AB-8樹(shù)脂柱中，以1.0 mL/min的流速通過(guò)，待樹(shù)脂達(dá)到平衡后，用60%的乙醇溶液1.0 mL/min進(jìn)行洗脫，分段收集，每段收集10 mL，測(cè)定流出液黃酮濃度，繪制洗脫曲線(xiàn)，見(jiàn)圖4。

圖4 AB-8樹(shù)脂吸附敗醬草黃酮洗脫曲線(xiàn)Fig.4 Elution curve of AB-8 resin adsorption patrinia flavonoids

由圖4可知，采用體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液，流速1.0 mL/min進(jìn)行洗脫，洗脫單一、尖銳、對(duì)稱(chēng)，沒(méi)有拖尾現(xiàn)象。表明80 mL的80%乙醇溶液基本已經(jīng)完全可以將敗醬草黃酮完全洗脫下來(lái)，在20 mL時(shí)的解吸率最大為72.94%。

2.8 大孔樹(shù)脂純化敗醬草黃酮正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇影響大孔樹(shù)脂純化敗醬草黃酮的幾個(gè)主要因素：吸附速率、洗脫速率、pH、乙醇體積分?jǐn)?shù)（洗脫液）按表1設(shè)計(jì)進(jìn)行正交試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

試驗(yàn)因素的影響大小為：洗脫速率/mL（B）>吸附速率/mL（A）>乙醇體積分?jǐn)?shù)/%（D）>pH 值（C），最優(yōu)工藝為：B2A2D3C3，即，洗脫速率 1.0mL，吸附速率 1.0mL，乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，pH值為7.5。

表4 大孔樹(shù)脂純化敗醬草黃酮正交試驗(yàn)結(jié)果L9（34）Table 4Results of orthogonal test of L9（34）for flavonoids purified from patrinia with porous resin

2.9 工藝驗(yàn)證

AB-8樹(shù)脂最佳工藝驗(yàn)證，為驗(yàn)證所選樹(shù)脂的可行性，按照已選的最佳工藝條件：用AB-8樹(shù)脂吸附敗醬草黃酮提取液中黃酮時(shí)的最佳動(dòng)態(tài)吸附條件：在室溫25℃，吸附速率為1.0 mL/min；洗脫過(guò)程，洗脫速率為1.0 mL/min，pH 7.5，洗脫液為80%的乙醇水溶液、用量為80 mL。進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，可得敗醬草黃酮回收率為89.6%（RSD=2.03%），純度達(dá)57.31%，結(jié)果表明在上述工藝條件下，AB-8樹(shù)脂對(duì)敗醬草黃酮吸附量大、洗脫率較高，且工藝的穩(wěn)定性良好，可作為工業(yè)生產(chǎn)的參考工藝。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用大孔吸附樹(shù)脂法從敗醬草提取液中分離黃酮類(lèi)化合物。通過(guò)靜態(tài)吸附法對(duì)AB-8、NKA、NKA-9、NKA-Ⅱ、D4006、H103、S-8、D4020、X-5 這 9種大孔樹(shù)脂進(jìn)行篩選，選出AB-8型樹(shù)脂吸附敗醬草中黃酮效果最佳。通過(guò)正交試驗(yàn)得出的最佳試驗(yàn)條件下，敗醬草黃酮回收率為89.6%（RSD=2.03%），經(jīng)AB-8型樹(shù)脂吸附敗醬草中黃酮純度由粗提液11.20%達(dá)57.31%，提高近5倍。因此，AB-8型大孔樹(shù)脂適合敗醬草中黃酮類(lèi)物質(zhì)的分離純化。