不同花色白芨四種DNA條形碼的序列分析

曾麗娜 劉顯義 石建龍

摘要：采用CTAB法提取2種花色白芨基因組DNA，選用trnH-psbA、rbcL、ITS、LSU D1-D3 4種植物DNA條形碼通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分析黃花、紫花白芨（Bletilla striata）4種DNA條形碼的序列，擴(kuò)增產(chǎn)物純化后連接T載體并測序，用DNAMAN軟件對測序結(jié)果進(jìn)行多序列比對分析。再根據(jù)SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，利用位點(diǎn)特異性PCR擴(kuò)增進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，4對植物DNA條形碼通用引物均能進(jìn)行擴(kuò)增，其中trnH-psbA序列沒有發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)、rbcL序列出現(xiàn)2個(gè)SNP位點(diǎn)、ITS序列出現(xiàn)62個(gè)SNP位點(diǎn)、LSU D1-D3序列出現(xiàn)3個(gè)SNP位點(diǎn)。根據(jù)LSU D1-D3序列上的2個(gè)SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)的引物DUAN5（5′-TAGTAACGGCGAGCGAAC-3′）和JDHH（5′-TTATCAGCTTCCTTGCGCCCG-3′）能準(zhǔn)確鑒定出黃花白芨，成功獲得鑒定黃花白芨的引物序列。

關(guān)鍵詞：白芨（Bletilla striata）；DNA條形碼；PCR；SNP

中圖分類號：R282 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2018）17-0106-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.17.027 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Abstract： Genomic DNA was extracted from the two kinds of color of Bletilla striata by using the CTAB method. To analysis the sequence of different flower color of Bletilla striata based on the four kinds of DNA barcode for further identification. Four DNA barcoding markers（trnH-psbA，rbcL，ITS and LSU D1-D3） were selected for PCR. PCR product was ligated into T vector for sequencing. The sequencing results were analyzed by using DNAMAN software. According to the SNP loci of different color of Bletilla striata， the primers were designed for identifying different color of Bletilla striata. Result showed that：two kinds of flower color of Bletilla striata genomic DNA can be amplified based on 4 pairs primers of plant DNA barcode markers and SNP loci were found. None SNP locus was found in trnH-psbA sequence. Two SNP loci were found in rbcL sequence. Sixty-two SNP loci were found in ITS sequence. Three SNP loci were found in LSU D1-D3 sequence. Primer DUAN5（5′-TAGTAACGGCGAGCGAAC-3′） and JDHH（5′-TTATCAGCTTCCTTGCGCCCG-3′） can be used for identifying the yellow flower color of Bletilla striata according to the SNP loci in LSU D1-D3 sequence. The primers were found for identifying the yellow flower color of Bletilla striata.

Key words： Bletilla striata； DNA barcode； PCR； SNP

白芨（Bletilla striata）為蘭科（Corchidaceae）白芨屬（Bletilla）多年生草本植物，是中國重要的中藥材。商品白芨為白芨屬白芨假鱗莖制成的干燥塊莖，性平味苦，具有斂氣、滲痰、止血、消腫等功效，主要用于治療咳血、吐血、外傷出血、潰瘍病出血等。白芨屬植物全世界共有6種，其中中國有4種，即華白芨（Bletilla sinensis）、小白芨（Bletilla formosana）、白芨（Bletilla striata）和黃花白芨（Bletilla ochracea）[1]。主要分布在貴州、廣西、安徽、四川、云南、陜西和湖北等地，其中以貴州、廣西、湖北、安徽野生種質(zhì)資源分布最為豐富。

由于白芨種子發(fā)育不完全，常規(guī)條件下很難發(fā)芽。近年來，隨著藥理研究的深入，市場需求強(qiáng)勁增長，人們瘋狂采挖野生資源，導(dǎo)致野生白芨資源急劇減少。為滿足日益增長的市場需求，白芨組培快繁技術(shù)與直播技術(shù)相繼研發(fā)成功[2-5]，全國各地掀起白芨人工種植熱潮。但是，用于繁育種苗的白芨果莢均沒有經(jīng)過品種選育，而是采集于野生白芨資源。于是，在白芨種植基地中普遍出現(xiàn)黃花、白花、紫花白芨混雜的情況，大大影響藥材安全?！吨袊幍洹芬?guī)定藥用的主要為紫花三叉白芨，其他黃花、白花白芨等都是習(xí)用品和偽品。為此，迫切需要研發(fā)能在幼苗或種莖時(shí)對黃花、白花、紫花白芨進(jìn)行快速鑒定的方法。

有關(guān)白芨屬植物的鑒定，已有從形態(tài)學(xué)、化學(xué)成分以及ISSR、RAPD等DNA分子標(biāo)記方面的報(bào)道[6-8]， 這些研究都為白芨屬藥用植物的鑒定提供了依據(jù)。DNA條形碼的出現(xiàn)，為白芨屬藥用植物的鑒定帶來了新的思路。DNA條形碼技術(shù)（DNA barcode）是利用相對較短的標(biāo)準(zhǔn)DNA片段對物種進(jìn)行快速、準(zhǔn)確鑒定的一門技術(shù)。由加拿大分類學(xué)家Paul Hebert 在2003年首次提出，該技術(shù)可以從分子水平彌補(bǔ)傳統(tǒng)鑒定方法的一些不足。DNA條形碼技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：①具有不受生物個(gè)體形態(tài)特征限制，只需小部分材料就能準(zhǔn)確鑒別大多數(shù)物種。②鑒定結(jié)果不受個(gè)體生長發(fā)育階段影響，從而加快鑒定進(jìn)程。③準(zhǔn)確性高。一個(gè)好的DNA條形碼應(yīng)符合的條件：①在種內(nèi)種間需要有明顯的遺傳變異和分化，同時(shí)種內(nèi)變異足夠小。②片段足夠短，便于一個(gè)反應(yīng)完成測序工作，而且便于DNA提取，滿足PCR擴(kuò)增，尤其是對存在DNA降解的材料。③存在保守區(qū)域，便于設(shè)計(jì)通用引物。DNA條形碼技術(shù)具有較好的通用性，只需選用一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)基因片段就可快速有效地鑒別物種，而且該技術(shù)操作簡便，具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，目前已得到廣泛的應(yīng)用。2014年，基于ITS2+trnH-psbA片段組合的中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)已初步建成，它系統(tǒng)收錄了中國藥典以及日本藥局方、韓國藥典、美國藥典、歐洲藥典和印度藥典所記載的23 262個(gè)物種（包含了95%以上的草藥藥材），共計(jì)78 847條DNA條形碼序列[9]。中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院完成了8 000余種中草藥白芨其混偽品的DNA條形碼研究，創(chuàng)建了“中藥材DNA條形碼生物鑒定體系”。驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)約220 bp的核基因組序列ITS2具有良好的鑒定效率，特別適合中藥材等存在DNA降解的材料。該序列明顯優(yōu)于國際生命條形碼聯(lián)盟推薦的400～800 bp葉綠體序列rbcL和matK聯(lián)合條形碼。trnH-psbA、rbcL、matK、ITS、ITS2、LSU D1-D3 6種DNA條形碼常用于藥用植物的物種鑒定[10]。

2014年，吳勁松等[11]選用nrDNA ITS、LFY同源基因內(nèi)含子2、葉綠體ycf1基因3種DNA條形碼對白芨屬藥用植物進(jìn)行了研究，研究結(jié)果表明，nrDNA ITS和ycf1序列可以作為白芨屬及其混偽品鑒定用的DNA條形碼。

單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNP），是指在基因組水平上由于單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。本試驗(yàn)通過對黃花白芨、紫花白芨的trnH-psbA、rbcL、ITS、LSU D1-D3序列進(jìn)行分析，并針對分析發(fā)現(xiàn)的SNP位點(diǎn)3′末端的堿基設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物，優(yōu)化PCR擴(kuò)增體系，以期能準(zhǔn)確鑒別黃花白芨和紫花白芨。

1 材料與方法

1.1 材料

采自貴州遵義市白芨種植基地的黃花白芨和紫花白芨，并經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)生藥學(xué)教研室龍慶德教授鑒定。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 各取黃花白芨、紫花白芨100 mg嫩葉，采用CTAB法提取其全基因組DNA。操作步驟參照《基因工程實(shí)驗(yàn)教程》中的植物組織基因組DNA的提取部分，略有改動(dòng)?；蚪MDNA用TE溶液溶解后，用0.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，其余保存于冰箱-20 ℃。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 選用文獻(xiàn)[10]中trnH-psbA、rbcL、ITS、LSU D1-D3 DNA條形碼的擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物見表1。使用梯度PCR儀摸索反應(yīng)條件和擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，熒光成像系統(tǒng)拍照保存。用回收試劑盒對特異目的條帶進(jìn)行回收純化。

1.2.3 PCR產(chǎn)物連接T載體與測序 按照T載體使用說明將回收的目的片段與T載體進(jìn)行連接，熱擊轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，依據(jù)藍(lán)白斑篩選重組轉(zhuǎn)化子。

1.2.4 重組轉(zhuǎn)化子的鑒定 挑選白色菌落接種于3 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)12～16 h。利用M13通用引物對菌液進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。

1.2.5 測序、序列比對分析 將鑒定正確的重組轉(zhuǎn)化子菌液送北京華大基因有限公司測序。用DNAMAN軟件對測序結(jié)果進(jìn)行拼接、序列比對，分析黃花、紫花白芨的序列差異。

1.2.6 SNP位點(diǎn)確認(rèn)、引物設(shè)計(jì)及PCR驗(yàn)證 根據(jù)序列分析發(fā)現(xiàn)的SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，設(shè)計(jì)主要依據(jù)3′端堿基要嚴(yán)格配對的原則。采用梯度PCR儀摸索擴(kuò)增反應(yīng)條件。利用該條件進(jìn)行重復(fù)3次的PCR擴(kuò)增，3次擴(kuò)增結(jié)果一致，則認(rèn)為該SNP位點(diǎn)真實(shí)存在，可用于鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA抽提

采用CTAB法分別抽提黃花白芨、紫花白芨基因組DNA。經(jīng)紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測，所提DNA吸光度值A(chǔ)260 nm/A280 nm比值均在1.8～2.0，無蛋白質(zhì)等污染。采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖1所示，所得條帶清晰，無拖尾現(xiàn)象，可滿足擴(kuò)增要求。

2.2 4種DNA條形碼通用引物的PCR擴(kuò)增

根據(jù)梯度PCR預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，確定4種DNA條形碼擴(kuò)增退火溫度分別為ITS 47 ℃，LSU D1-D3 56 ℃，trnH-psbA為58 ℃，rbcL為55 ℃。4種DNA條形碼擴(kuò)增序列長度分別為ITS序列762 bp，LSU D1-D3序列760 bp，trnH-psbA序列約896 bp，rbcL序列598 bp，PCR擴(kuò)增電泳檢測結(jié)果如圖2所示。4種DNA條形碼均能擴(kuò)增出相應(yīng)大小的特異條帶。

2.3 擴(kuò)增產(chǎn)物與T載體連接、轉(zhuǎn)化及重組子鑒定

將特異PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，并與T載體進(jìn)行連接，然后熱擊轉(zhuǎn)化、涂板。培養(yǎng)過夜后，挑選白色菌落進(jìn)行培養(yǎng)。選用T載體上的M13通用引物進(jìn)行重組子的鑒定，其中rbcL重組子鑒定電泳結(jié)果見圖3。第1、2、3泳道的M13引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大于第4泳道的rbcL通用引物擴(kuò)增產(chǎn)物，顯示連接成功。將鑒定連接好的重組子菌液送北京華大基因有限公司測序。

2.4 序列分析

用DNAMAN軟件對測序結(jié)果作多序列比對分析，其中ITS序列總長762 bp，2種花色一致性91.87%，共有62個(gè)SNP位點(diǎn)，是4種DNA條形碼序列中SNP位點(diǎn)最多的序列；LSU D1-D3序列總長760 bp，2種花色一致性99.61%，3個(gè)SNP位點(diǎn)。rbcL序列總長598 bp，2種花色一致性99.67%，2個(gè)SNP位點(diǎn)；trnH-psbAF序列總長896 bp，2種花色一致性100%，序列完全一致。具體見表2和表3。

2.5 SNP位點(diǎn)確認(rèn)及鑒定

根據(jù)LSU D1-D3序列636和641位點(diǎn)SNP設(shè)計(jì)引物，上游引物為DUAN5：（5′-TAGTAACGGCGAGCGAAC-3′）；下游引物則根據(jù)3′端堿基要嚴(yán)格配對的原則進(jìn)行設(shè)計(jì)，命名為JDHH，序列為5′-TTATCAGCTTCCTTGCGCCCG-3′。2個(gè)斜體G即為黃花白芨636和641位點(diǎn)的2個(gè)C，擴(kuò)增產(chǎn)物大小約640 bp。利用梯度PCR儀摸索擴(kuò)增條件，最佳退火溫度為54 ℃。擴(kuò)增體系為30 μL體系中6 μL 5×Taq buffer，dNTPs 2.4 μL，1 μL引物（終濃度0.4 μmol/L），1 μL模板（終濃度約60 ng），Taq酶0.15 μL，ddH2O加至30 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸10 min，4 ℃保存。分別利用該反應(yīng)程序?qū)ψ匣ò总浮ⅫS花白芨進(jìn)行擴(kuò)增鑒定，結(jié)果3次重復(fù)試驗(yàn)均獲得一致結(jié)果，即只有黃花白芨有相應(yīng)擴(kuò)增條帶，而紫花白芨沒有擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果如圖4所示。表明這2個(gè)SNP位點(diǎn)真實(shí)存在，所設(shè)計(jì)的引物可用于鑒定黃花白芨。

3 討論

ITS、trnH-psbA、rbcL、LSU D1-D3 DNA條形碼已廣泛應(yīng)用于多種物種的鑒定中。本試驗(yàn)中，這4種DNA條形碼對紫花、黃花2種花色白芨均能進(jìn)行PCR擴(kuò)增，連接T載體后的測序結(jié)果也均能找到上下游引物。其中ITS是核糖體DNA的非編碼區(qū)，承受著較小的選擇壓力，因此ITS序列進(jìn)化速度較快、變異較大，長度適中，常用于物種的鑒定[12]。黃花白芨、紫花白芨ITS序列分析結(jié)果也顯示，相比其他3種DNA條形碼，ITS序列差異最大，多達(dá)62個(gè)SNP位點(diǎn)。吳勁松等[11]的研究結(jié)果顯示，核基因nrDNA ITS和葉綠體基因ycf1序列均可作為白芨屬鑒定的有效DNA條形碼，并采用單片段nrDNA ITS或ycf1基因序列就能成功鑒定出白芨屬物種及其混偽品。

trnH-psbA序列是進(jìn)化速率較快的葉綠體間隔區(qū)之一。trnH-psbA兩端有75 bp的保守區(qū)序列，為設(shè)計(jì)通用引物提供了較大的便利[13]。從各類DNA條形碼技術(shù)的報(bào)道和相關(guān)文獻(xiàn)來看，ITS序列和trnH-psbA序列適合鑒別種級的不同個(gè)體[14]，但本試驗(yàn)結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)黃花白芨和紫花白芨的trnH-psbA序列完全一樣，沒有差異，值得深入研究，即trnH-psbA序列不適合用于鑒別黃花白芨、紫花白芨。

rbcL基因?yàn)槿~綠體基因，編碼核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶的大亞基。由于葉綠體DNA序列和結(jié)構(gòu)的高度保守性[15]，rbcL基因的差異小，PCR擴(kuò)增容易，在植物種屬鑒定中也得到了廣泛應(yīng)用。2009年國際條形碼工作組提出matK+rbcL這兩個(gè)序列作為通用的條形碼序列[16]。黃花白芨與紫花白芨rbcL序列只存在2個(gè)SNP位點(diǎn)，且相距相對較遠(yuǎn)，不適宜設(shè)計(jì)引物進(jìn)行鑒定。

核糖體大亞基（LSU）DNA（rDNA）含有12個(gè)擴(kuò)增片段（D1-D12），為用作條形碼提供選擇[17]。28S rDNA D1-D3（LSU D1-D3）已被廣泛用于鑒定藥用植物。LSU D1-D3序列的通用引物在黃花白芨、紫花白芨中均能進(jìn)行有效擴(kuò)增，序列分析發(fā)現(xiàn)存在3個(gè)SNP位點(diǎn)，而且其中有2個(gè)SNP位點(diǎn)隔得很近，非常適合設(shè)計(jì)引物用于鑒定。PCR結(jié)果也證明該位點(diǎn)真實(shí)存在，通過PCR條帶的有無就可鑒定黃花白芨和紫花白芨，出現(xiàn)條帶的為黃花白芨，沒有條帶的為紫花白芨。

SNP位點(diǎn)的解析是分析種間差異小的種群的一個(gè)重要手段[18]。本研究通過對紫花白芨、黃花白芨 ITS、trnH-psbA、rbcL、LSU D1-D3 DNA條形碼序列變異位點(diǎn)進(jìn)行分析后，發(fā)現(xiàn)ITS、rbcL、LSU D1-D3 DNA條形碼在紫花白芨和黃花白芨間存在穩(wěn)定的SNP位點(diǎn)，這些位點(diǎn)的存在使2種花色白芨相互鑒別成為可能。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這些SNP位點(diǎn)的準(zhǔn)確性，本研究就白芨藥材（紫花白芨）和黃花白芨LSU D1-D3 DNA條形碼序列的特異性位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，采用梯度PCR篩選最佳退火溫度，優(yōu)化擴(kuò)增條件。通過凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增條帶的有無，就可將白芨藥材（紫花白芨）和黃花白芨進(jìn)行鑒別。

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