高效液相色譜法測(cè)定染發(fā)劑中14種染料

(遼寧省分析科學(xué)研究院 遼寧省標(biāo)準(zhǔn)化體系建設(shè)工程技術(shù)研究中心， 沈陽 110015)

染發(fā)劑是通過改變頭發(fā)顏色，達(dá)到美化毛發(fā)之目的的一類化妝品。隨著社會(huì)生活水品的不斷提高，人們開始注重生活質(zhì)量和消費(fèi)質(zhì)量，染發(fā)作為美容的方式之一，越來越受到人們的青睞，城市中青少年彩色染發(fā)者逐年增多，同時(shí)中老年人群中的使用者比例也逐漸上升。世界衛(wèi)生組織研究表明,長(zhǎng)期使用染發(fā)產(chǎn)品可導(dǎo)致頭發(fā)脫落、皮膚過敏、皮膚癌、惡性腫瘤、肝臟損害和泌尿系統(tǒng)疾病,同時(shí)某些染發(fā)劑中的染料所具有雌激素效應(yīng)的該類化合物也易危害生殖系統(tǒng)的健康。為了保障消費(fèi)者的身體健康,歐盟78/ 768/ EEC 及2003/ 15/ EC 的增補(bǔ)指令[1，2]、日本化妝品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，及我國(guó)《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》2015版[3]規(guī)定了染發(fā)劑中相關(guān)染料的一些檢測(cè)方法。為滿足國(guó)內(nèi)外法規(guī)的要求,積極開展染發(fā)劑中多種類染料的檢測(cè)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。對(duì)苯二胺等有機(jī)胺類染料作為典型的染料被廣泛的使用在黑色染發(fā)劑中[4]。針對(duì)種類繁多的染料成分，各國(guó)科學(xué)家一直在積極的研究新的檢測(cè)方法以適應(yīng)不斷增加的染發(fā)劑的檢測(cè)要求，在檢測(cè)染料這一領(lǐng)域，主要采用氣相色譜-質(zhì)譜( GC-MS )[5，6]、毛細(xì)管電泳(CE)[7]、高效液相色譜(HPLC)[8-10]和高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)[11]等分析方法，針對(duì)染料成分具有強(qiáng)極性，低揮發(fā)性及不穩(wěn)定性的特點(diǎn)，HPLC是最理想的檢測(cè)染料的方法。本文以磷酸鹽緩沖溶液-乙腈為流動(dòng)相，建立了染發(fā)劑中對(duì)苯二胺等14中染料成分的高效液相色譜法，并對(duì)市售的染發(fā)劑進(jìn)行了測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent1200高效液相色譜儀，配二極管陣列檢測(cè)器(DAD0和自動(dòng)進(jìn)樣器，KQ3200DE型速控超聲波清洗器，Techcomp CT14RD 離心機(jī)，Sartorius BT25S電子天平。

標(biāo)準(zhǔn)品：對(duì)苯二胺、鄰氨基苯酚等標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于Accu Standard公司；鄰苯二胺、對(duì)氨基苯酚、間氨基苯酚、甲苯-2，5-二胺硫酸鹽、間苯二酚、2-硝基對(duì)苯二胺、甲苯-3，4二胺等標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于Dr.E公司；2-氯對(duì)苯二胺硫酸鹽、4-氨基-2-羥基甲苯、2-甲基間苯二酚、6-氨基間甲酚購(gòu)于EPURE公司；4-氨基-3-硝基苯酚購(gòu)于TRC公司。

試劑：乙腈 色譜級(jí) sigma公司購(gòu)買；庚烷磺酸鈉 色譜級(jí) 美國(guó)Tchnologies公司購(gòu)買；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、磷酸、亞硫酸氫鈉和無水乙醇均為分析純，購(gòu)物北京化學(xué)試劑公司。

磷酸鹽緩沖溶液(稱取磷酸氫二鈉1.8g、磷酸二氫鉀2.8g和庚烷磺酸鈉1.0g，加水溶解并稀釋至1L，搖勻，再用10%磷酸溶液調(diào)節(jié)pH 至6)。

提取溶劑：50%無水乙醇水溶液。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件

RP-AMIDE C16保護(hù)柱(20mm×4mm×5μm)，RP-AMIDE C16柱(250mm×4.6mm×5μm)，流速1.0mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)280nm，柱溫25℃，進(jìn)樣量5μL，流動(dòng)相為乙腈-磷酸鹽混合溶液梯度洗脫，見表1。

表1 乙腈-磷酸鹽混合溶液梯度洗脫表

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

精密稱取2-硝基對(duì)苯二胺標(biāo)準(zhǔn)品約25.0mg(精確至0.0001mg)，置10mL 容量瓶中加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，制成約2.5mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液；其余染料標(biāo)準(zhǔn)品各精密稱取約100.0mg(精確至0.0001mg)，分別置10mL容量瓶中，加稀釋液溶解并稀釋至刻度，配制成約10mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(甲苯-2，5-二胺硫酸鹽和2-氯對(duì)苯二胺硫酸鹽用2g/L亞硫酸氫鈉水溶液溶解并定容；甲苯-3,4-二胺和4-氨基-2-羥基甲苯用無水乙醇定容)，儲(chǔ)備溶液保存于4℃冰箱中。

分別用移液槍移取上述14 種染料的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液各1.25mL(2-硝基對(duì)苯二胺移取5mL)至25mL容量瓶中，加稀釋液稀釋至刻度，搖勻，制成約500mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。移取適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，加稀釋液稀釋至所需濃度。

1.2.3 樣品溶液的制備

稱取擠出1cm后的樣品約0.5g，置10mL具塞比色管中，加稀釋液稀釋至刻度，渦旋混勻1min，冰浴超聲提取15min，7000rpm離心5min，取上清液用0.45μm 微孔濾膜過濾，濾液作為待測(cè)溶液。如溶液中染料濃度超出線性范圍時(shí)，取超聲提取后溶液5mL，加稀釋液稀釋至25mL，搖勻，7000rpm離心5min，，取上清液用0.45μm 微孔濾膜過濾，濾液作為待測(cè)溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱和流動(dòng)相的選擇

根據(jù)目標(biāo)染料成分的結(jié)構(gòu)性質(zhì)以及文獻(xiàn)查閱結(jié)果，考察了Zorbax SB C18柱(250mm×4.6mm×5μm)和RP-AMIDE C16柱(250mm×4.6mm×5μm)兩種色譜柱。結(jié)果表明采用RP-AMIDE C16柱(250mm×4.6mm×5μm)時(shí)，色譜峰峰形能夠得到很好的改善。這是因?yàn)镽P-AMIDE C16柱(250mm×4.6mm×5μm)色譜柱中含有酰胺結(jié)構(gòu)，適宜分離胺類化合物，因此采用該色譜柱為分析柱。乙腈-磷酸鹽體系的流動(dòng)相比較適合14種染料的檢測(cè)，我國(guó)《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》2015版給出的流動(dòng)相比例在實(shí)際檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)不能很好的將鄰氨基苯酚和2-氯對(duì)苯二胺硫酸鹽分離，故而采取梯度洗脫模式，14種染料的分離色譜圖見圖1。

圖1 14種染料的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖1.對(duì)苯二胺；2.對(duì)氨基苯酚；3.間氨基苯酚；4.鄰苯二胺；5.甲苯-2，5-二胺硫酸鹽；6.2-氯對(duì)苯二胺硫酸鹽；7. 鄰氨基苯酚；8. 間苯二酚；9.2-硝基對(duì)苯二胺；10.2-甲基間苯二酚；11.甲苯-3，4-二胺；12.4-氨基-2-羥基甲苯；13.6-氨基間甲酚；14.4-氨基-3-硝基苯酚

2.2 樣品溶液制備的優(yōu)化

染發(fā)劑非常容易氧化，稱取擠出1cm后的樣品可以避免取到開口處被氧化的樣品，這樣可以對(duì)含量測(cè)定的結(jié)果不造成影響。渦旋后超聲可以使樣品混合提取更均勻更徹底。冰浴超聲溫度低而且比較穩(wěn)定，能夠使樣品氧化的速度減緩。染發(fā)劑的基底成分比較復(fù)雜，低轉(zhuǎn)速的離心后分層不夠理想，采用7000rpm離心5min后發(fā)現(xiàn)分層效果理想。

2.3 方法的線性和檢出限

配置10mg/L、25mg/L、50mg/L、100 mg/L、250mg/L和500mg/L系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液做標(biāo)準(zhǔn)曲線。以S/N=3為檢出限，S/N=10為定量限，結(jié)果見表2。

表2的結(jié)果表明在10 mg/L～500mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，各染料成分的峰面積和對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均高于0.999。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋，計(jì)算信噪比(S/N)。

表2 14種染料成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.4 方法的回收率及精密度

稱取樣品約0.5g，置10mL 比色管中，分別加入500mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液適量后，加稀釋液稀釋至刻度。按樣品溶液制備方法制備樣品(平行制備3 份)并進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得14 種染料組分的平均回收率為85%～110%之間。取100mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，得14種染料峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.20%～1.98%，滿足分析要求。

2.5 樣品分析

對(duì)市售8款膏狀染發(fā)劑中染料進(jìn)行測(cè)定。樣品中檢測(cè)出不同濃度的對(duì)苯二胺、對(duì)氨基苯酚、甲苯-2，5-二胺硫酸鹽、鄰氨基苯酚、間苯二酚，其余9種染料均未檢出。8 款樣品中對(duì)苯二胺檢出率最高，最高濃度為1.4%，但未超過《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》規(guī)定限量。

3 結(jié)論

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)建立了高效液相色譜法檢測(cè)染發(fā)劑中14種染料的方法。對(duì)色譜條件和樣品前處理方法進(jìn)行了優(yōu)化。該方法高效便捷，重現(xiàn)性好，較好的覆蓋了目前染發(fā)劑中常用的染料的檢測(cè)，可用于染發(fā)劑安全方面的監(jiān)管。