常春油麻藤離體再生體系建立試驗(yàn)

游云飛

(福州植物園，福建 福州 350012)

常春油麻藤(MucunasempervirensHemsl)別名牛馬藤、常春黎豆藤，為豆科(Leguminosae)油麻藤屬(Mucuna)常綠木質(zhì)藤本，適應(yīng)性強(qiáng)，南方各省大部分地區(qū)都有分布，是一種優(yōu)良的綠化觀賞植物，能在不同生長條件下迅速形成景觀[1-2]。常春油麻藤可防暑降溫，吸滯塵埃，減少噪音，凈化空氣，并且對硫、氯氣等有害氣體有較強(qiáng)的吸附能力和凈化能力，可利用它進(jìn)行環(huán)境治理，凈化空氣，美化環(huán)境，穩(wěn)固土壤，提高環(huán)境質(zhì)量，起到良好的生態(tài)防護(hù)功能[3-4]。在藥用方面，常春油麻藤全株可供藥用，性溫，味苦，具有活血、通經(jīng)活絡(luò)之功效，主治關(guān)節(jié)風(fēng)濕痛、跌打損傷、血虛等[5]，同時(shí)常春油麻藤莖皮可織草袋及造紙，枝條可編籮筐，塊根可提取淀粉，種子可食用和榨油[6]。

我國有關(guān)常春油麻藤的研究主要集中在生長抗逆性和開發(fā)應(yīng)用等方面，何錚昳等[7-9]對昆明地區(qū)種植常春油麻藤進(jìn)行物候觀測研究，得出常春油麻藤生長狀況存在一定的差異性；蘆夕琴等[10]在常春油麻藤開發(fā)利用中得出必須加強(qiáng)對常春油麻藤現(xiàn)有資源的保護(hù)，擴(kuò)大人工種植面積，且種子、莖皮均具備藥用價(jià)值，應(yīng)加深綜合利用程度。針對目前市場對常春油麻藤植株的旺盛需求，本研究對常春油麻藤進(jìn)行離體繁育研究，避開季節(jié)限制進(jìn)行大量繁殖，以期提高常春油麻藤繁殖速率和效益，為常春油麻藤植物資源保育和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供技術(shù)支持和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料采自福建閩清黃楮林原始森林內(nèi)，選用種皮飽滿、無病蟲害，成熟度分別為30%(6—7月采集)、60%(8—9月采集)、90%(10—11月采集)、100%(11—12月采集)莢果種子為繁育外植體(圖1a～圖1c)。

圖1 常春油麻藤莢果及種子

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體消毒處理 剝?nèi)デv果外殼，取出種子置于飽和漂白粉上清液中泡洗15 min后用流水沖洗干凈，雙蒸水沖蕩2～3次，置超凈工作臺上用75%酒精浸泡30 s，0.1%升汞進(jìn)行消毒，消毒處理時(shí)間分別為5、7、9、11、13、15 min。消毒完畢后用無菌水沖洗3～4遍并用消毒濾紙吸干接種材料表面水分，用手術(shù)刀和槍狀鑷配合切除種子外殼種皮部分，接入經(jīng)高壓滅菌的MS培養(yǎng)基上，接種種子斜插于培養(yǎng)基上，每瓶接種1～2粒，每個(gè)處理接種20瓶，試驗(yàn)重復(fù)3次。隨時(shí)觀察記錄種子萌發(fā)情況，14 d后統(tǒng)計(jì)污染率：污染率(%)=(污染外植體數(shù)/接種總數(shù))×100%。

1.2.2 不同植物生長調(diào)節(jié)劑濃度配比組合下胚芽的誘導(dǎo) 以MS為基本培養(yǎng)基，設(shè)置6-BA(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg·L-1)與KT 1.0 mg·L-1和NAA 0.5 mg·L-1配合共5個(gè)處理，研究不同濃度植物生長調(diào)節(jié)劑組合對胚芽啟動培養(yǎng)的影響。當(dāng)胚芽植株莖段達(dá)到高5～6 cm時(shí)，切下1～2 cm上胚軸莖段，接種在莖段芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每瓶培養(yǎng)基接種2～3個(gè)莖段，每個(gè)處理接種30瓶。30 d后觀察記錄常春油麻藤外植體的變化情況并統(tǒng)計(jì)芽的分化率以及芽誘導(dǎo)率：分化率(%)=(分化芽數(shù)/接種數(shù))×100%，芽誘導(dǎo)率(%)=(芽誘導(dǎo)種子個(gè)數(shù)/種子總個(gè)數(shù))×100%。

1.2.3 不同植物生長調(diào)節(jié)劑濃度配比下不定芽的增殖 以MS為基本培養(yǎng)基，設(shè)置6-BA 2.0 mg·L-1、NAA 0.3 mg·L-1、KT 0.5 mg·L-1與TDZ(0.005、0.01、0.02、0.03、0.04 mg·L-1)配合，共5個(gè)處理，研究不同濃度植物生長調(diào)節(jié)劑配比對不定芽增殖的影響。將腋芽誘導(dǎo)成功的植株按上部、中部切割成帶一腋一芽的莖段接種在不定芽增殖培養(yǎng)基上，每瓶接種2～3個(gè)帶芽莖段，每個(gè)處理接種30瓶，重復(fù)3次。30 d后觀察記錄常春油麻藤芽增殖情況并統(tǒng)計(jì)其增殖系數(shù)。誘導(dǎo)芽分化率(%)=(愈傷塊數(shù)/總愈傷塊數(shù))×100%。

1.2.4 不同光照時(shí)間和光照強(qiáng)度下芽增殖誘導(dǎo)培養(yǎng) 設(shè)置不同光照時(shí)間(0、4、8、12、14 h)及不同光照強(qiáng)度(0、500、1000、1500、2000 lx)，研究不同光照時(shí)間和光照強(qiáng)度對誘導(dǎo)芽增殖培養(yǎng)的影響，每個(gè)處理10瓶，重復(fù)3次。30 d后統(tǒng)計(jì)不同條件下芽增殖誘導(dǎo)率：芽增殖誘導(dǎo)率(%)=(芽增殖誘導(dǎo)個(gè)數(shù)/總個(gè)數(shù))×100%。

1.2.5 不同植物生長調(diào)節(jié)劑濃度配比下壯苗培養(yǎng) 以MS為基本培養(yǎng)基，6-BA 1.0 mg·L-1、KT 0.5 mg·L-1、NAA 0.3 mg·L-1與IBA(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg·L-1)配合，共5個(gè)處理，研究不同IBA濃度配比組合對不定芽壯苗培養(yǎng)的影響。當(dāng)增殖芽高度達(dá)到3～4 cm時(shí)，將生長健壯的無根植株單株進(jìn)行分離切割，接種在壯苗培養(yǎng)基上，每瓶接種2～3株，接種30瓶，重復(fù)3次。觀察并記錄壯苗情況。

1.2.6 不同比例基本培養(yǎng)基生根誘導(dǎo) 以MS為基本培養(yǎng)基，設(shè)置MS、1/2 MS、1/3 MS、1/4 MS、1/5 MS共5個(gè)處理，每個(gè)處理包含IBA 0.5 mg·L-1、BA 2.0 mg·L-1、NAA 0.3 mg·L-1，研究基本培養(yǎng)基大量元素含量變化與植物生長調(diào)節(jié)劑配比對不定芽生根的影響。當(dāng)植株生長高達(dá)4～6 cm時(shí)，將經(jīng)壯苗培養(yǎng)的無根植株轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行根誘導(dǎo)培養(yǎng)，每瓶接種1～2株，接種30瓶，重復(fù)3次。記錄并統(tǒng)計(jì)常春油麻藤無根植株生根情況：生根率(%)=(生根苗數(shù)/總苗數(shù))×100%。

1.2.7 培養(yǎng)條件 以上培養(yǎng)基在胚芽誘導(dǎo)、不定芽繼代增殖培養(yǎng)階段均添加蔗糖20 g·L-1，壯苗生根培養(yǎng)階段添加蔗糖25 g·L-1，固化用瓊脂粉5.6 mg·L-1，活性炭1.0 g·L-1，pH值5.8。培養(yǎng)溫度(23±2) ℃，光照強(qiáng)度1000～2000 Lx，光照時(shí)間10 h·d-1。

1.2.8 煉苗移栽 經(jīng)生根培養(yǎng)后選擇生長狀態(tài)良好的瓶苗進(jìn)行煉苗。在自然光照狀態(tài)下煉苗培養(yǎng)7～10 d，松開瓶蓋1/2煉苗1～2 d，然后將瓶蓋完全揭開煉苗1～2 d。移栽基質(zhì)體積比為泥炭土∶珍珠巖∶蛭石=5∶1∶2，移栽時(shí)，用鑷子把移栽苗小心地從培養(yǎng)瓶內(nèi)取出，用自來水清洗干凈附著在根部的殘留培養(yǎng)基，應(yīng)避免傷及根部，適當(dāng)瀝干(水不滴落)，移入已準(zhǔn)備好的基質(zhì)中并壓實(shí)澆足水分后擺放在陰涼通風(fēng)處。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析和多重比較分析(Duncan′s)法。

2 結(jié)果與分析

2.1 腋芽誘導(dǎo)

2.1.1 不同消毒時(shí)間對常春油麻藤外植體污染的影響 由表1可以看出，不同成熟度種子在不同消毒時(shí)間污染變化的趨勢相同，30%、60%、90%、100%成熟度種子在消毒時(shí)間增加的情況下，污染率先下降后上升。消毒時(shí)間為5、7、9、11 min時(shí)，不同成熟度種子隨著消毒時(shí)間的增加而污染率下降；當(dāng)消毒時(shí)間達(dá)到13、15 min時(shí)，污染率又呈現(xiàn)明顯上升的趨勢，種子生物活性被破壞，增加了污染率；消毒時(shí)間為11 min時(shí)達(dá)到最低峰，即污染率最低狀態(tài)。因此，常春油麻藤種子接種最適消毒時(shí)間為11 min，污染率為1.67%。

表1 不同消毒時(shí)間對常春油麻藤外植體污染的影響

*：不同小寫字母為差異顯著。

2.1.2 莢果種子成熟度對芽誘導(dǎo)率的影響 由圖2、表2可以看出，種子不同成熟度對芽誘導(dǎo)率有很大影響，成熟度60%種子有利于種子萌發(fā)，芽誘導(dǎo)率最高達(dá)到70.45%；其次為成熟度90%種子，芽誘導(dǎo)率達(dá)到50.64%；成熟度30%種子太幼嫩，組織結(jié)構(gòu)尚稚嫩，芽誘導(dǎo)率最低，僅5.00%；成熟度100%的種子由于發(fā)育完全，誘導(dǎo)率在相同條件下保持在19.6%，與其它處理差異顯著。

圖2 不同成熟度莢果芽誘導(dǎo)生長情況

2.1.3 不同植物生長調(diào)節(jié)劑濃度配比組合對腋芽誘導(dǎo)的影響 由表3看出，在不同濃度的BA溶液處理?xiàng)l件下，成熟度30%的種子表現(xiàn)不敏感，這與外植體過于幼嫩，胚尚未形成相關(guān)；成熟度60%的種子芽誘導(dǎo)率均高于成熟度90%的種子和成熟度100%的種子。

表2 莢果種子成熟度對芽誘導(dǎo)率影響

隨著BA濃度增加，芽誘導(dǎo)率表現(xiàn)出先升后降的趨勢，變化較明顯，各試驗(yàn)組變化趨勢相同，BA 2.0 mg·L-1時(shí)達(dá)到最大值，成熟度30%誘導(dǎo)率為13.22%，成熟度60%誘導(dǎo)率為70.45%，成熟度90%誘導(dǎo)率為45.46%，而成熟度100%誘導(dǎo)率僅為24.16%；BA濃度繼續(xù)增加，達(dá)到2.5、3.0 mg·L-1時(shí)，芽誘導(dǎo)率有明顯下降，不同成熟度種子芽誘導(dǎo)率表現(xiàn)出相似的變化情況。成熟度100%的種子胚芽誘導(dǎo)率極低，不會隨BA濃度變化表現(xiàn)出明顯的差異性。常春油麻藤種子胚芽誘導(dǎo)率會因?yàn)椴烧獣r(shí)間不同而生長狀態(tài)明顯不同，成熟度60%的種子芽誘導(dǎo)率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于成熟度100%的種子。誘導(dǎo)種子發(fā)芽的最適成熟度為60%，最適宜的BA溶液質(zhì)量濃度為2.0 mg·L-1。

表3 不同植物生長調(diào)節(jié)劑濃度組合下各成熟度種子芽誘導(dǎo)率

*：每處理均添加KT 1.0 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1。

2.2 不定芽增殖培養(yǎng)

2.2.1 不同TDZ濃度對芽分化率的影響 由表4、圖3可看出，TDZ 0.01、0.02 mg·L-1能縮短芽分化時(shí)間；TDZ 0.03 mg·L-1在15 d以前會有較小促進(jìn)分化作用，15 d以后則抑制芽分化并停止生長；而TDZ 0.04 mg·L-1溶液則會抑制芽的分化。經(jīng)過TDZ 0.02 mg·L-1溶液處理的試驗(yàn)組，莖段芽分化率在25 d左右達(dá)到最大值；沒有加入TDZ溶液的對照組，45 d左右分化率達(dá)到100%。說明TDZ 0.02 mg·L-1溶液能減少約20 d時(shí)間達(dá)到100%分化率，即最適TDZ質(zhì)量濃度為0.02 mg·L-1。

表4 不同TDZ濃度對芽分化率的影響

*：每處理均添加6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1+KT 0.5 mg·L-1。

圖3 TDZ不同濃度處理對芽分化的影響

2.2.2 光照時(shí)間和強(qiáng)度對誘導(dǎo)芽增殖培養(yǎng)的影響 由表5可看出，不同光照時(shí)間下，隨著光照強(qiáng)度的增加，增殖率先增加后減小，1500 lx時(shí)達(dá)到最大值。在500、2000 lx強(qiáng)度下，不同光照時(shí)間內(nèi)芽的誘導(dǎo)增殖率變化不明顯，差異不顯著，在1500 lx強(qiáng)度下，隨著光照時(shí)間的增加，增殖率先增加后減小，12 h達(dá)到最大值，并與其它組合差異顯著。誘導(dǎo)芽的增殖培養(yǎng)最適光照時(shí)間為12 h，最適光照強(qiáng)度為1500 lx，此條件下誘導(dǎo)率能達(dá)到最大值70.33%，當(dāng)光照時(shí)間或光照強(qiáng)度高于或低于這個(gè)值時(shí)，均不利于芽增殖和誘導(dǎo)。

2.3 不同植物生長調(diào)節(jié)劑與IBA組合對壯苗的影響

誘導(dǎo)后的生長植株莖節(jié)纖細(xì)弱小，應(yīng)進(jìn)一步將芽苗轉(zhuǎn)接到壯苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)，由表6、圖4可知，培養(yǎng)10 d莖段開始增粗和伸長，莖纖維逐漸增強(qiáng)，但仍較弱小，葉片尚未展開；培養(yǎng)20 d莖段繼續(xù)生長，同時(shí)葉片也開始展開，葉片呈淺綠色；培養(yǎng)30 d，莖段及葉片長勢良好。IBA 1.0 mg·L-1處理最佳。

表5 不同光照時(shí)間和強(qiáng)度對芽增殖誘導(dǎo)的影響

表6 壯苗培養(yǎng)生長情況

2.4 生根培養(yǎng)

2.4.1 基本培養(yǎng)基大量元素比例對無根苗生根的影響 由表7可知，大量元素濃度較低時(shí)，能促進(jìn)常春油麻藤無根苗生根，長勢好。隨著大量元素濃度增加，生根率下降，長勢變差；當(dāng)大量元素濃度達(dá)到最高時(shí)，其生根率為最低，甚至停止生長。由此可知，常春油麻藤無根植株在基本培養(yǎng)基1/2 MS上生根效果最好，1/2 MS培養(yǎng)基可作為常春油麻藤無根苗生根培養(yǎng)的最佳選擇。

2.4.2 不同濃度IBA培養(yǎng)基組合對無根苗生根的影響 由表8可知，不同濃度的IBA溶液都能在一定程度上促進(jìn)生根，其中IBA 1.0 mg·L-1溶液生根長度最大，根長達(dá)到9.54 cm。

圖4 壯苗培養(yǎng)

2.5 煉苗移栽

由于常春油麻藤適應(yīng)性強(qiáng)，只要保證苗期水分供應(yīng)及肥料的適當(dāng)補(bǔ)充，常春油麻藤生長良好，移栽成活率可達(dá)90%以上(圖5)。

3 小結(jié)與討論

3.1 取材時(shí)間

外植體取材時(shí)間相對于種子成熟度和常春油麻藤再生體系建立有著重要的影響，不同取材時(shí)間對種子成熟狀態(tài)和誘導(dǎo)萌發(fā)有影響，本研究表明成熟度越高的種子芽誘導(dǎo)率越低，污染率越高，褐化現(xiàn)象嚴(yán)重，選擇成熟度60%種子芽誘導(dǎo)率高。

表7 大量元素含量對無根苗

圖5 生根及移栽

由于常春油麻藤為熱帶、亞熱帶植物，在6月份的時(shí)侯會出現(xiàn)生殖生長和營養(yǎng)生長重疊的現(xiàn)象[8-10]，植物的各個(gè)部位為了爭奪營養(yǎng)提升競爭力，芽和果實(shí)都有很高的生活力；而10月份以后的成熟果實(shí)由于缺少競爭，生活力也自然會低于6月份的果實(shí)，選擇此時(shí)的果實(shí)作為接種材料將大大提高種子發(fā)芽率。

表8 IBA不同濃度對生根長度的影響

6—7月成熟度30%的種子，組織結(jié)構(gòu)尚稚嫩，一方面胚尚未完全發(fā)育形成，成熟度過于幼嫩的種胚萌發(fā)率通常不到5.00%，有的甚至完全不萌發(fā)；另一方面是種臍剝除及部分種皮切除后種胚汁腋豐富，經(jīng)過消毒處理，會受消毒劑的毒害，離體培養(yǎng)階段容易產(chǎn)生褐化現(xiàn)象。完全成熟的種子，褐化死亡少，但萌發(fā)率低(一般不到5%)，有的長時(shí)間不萌發(fā)。而成熟度60%的種子經(jīng)切除種臍消毒處理，極少發(fā)生褐化現(xiàn)象，萌發(fā)率達(dá)70.45%，而且萌發(fā)快，萌發(fā)時(shí)間短，一般在15 d便開始萌動，25 d胚芽高度可達(dá)4 cm，且有葉片長出。成熟度90%種子，種臍黑色，并包圍著種子的3/4，褐化現(xiàn)象嚴(yán)重，萌發(fā)率低，生長緩慢。成熟度100%的種子褐化現(xiàn)象更嚴(yán)重，芽誘導(dǎo)率極低。需要指出的是，接種后15 d的暗培養(yǎng)至關(guān)重要，可避免因多酚復(fù)合物質(zhì)的產(chǎn)生，而導(dǎo)致培養(yǎng)外植體褐化毒害而死亡，種子成熟初期胚尚未完全發(fā)育形成難以誘導(dǎo)，而種子完全成熟后期誘導(dǎo)率呈下降趨勢，因此選擇合適的種子成熟期是技術(shù)的關(guān)鍵。

3.2 光照條件

常春油麻藤在自然情況下生長于海拔300 m以上，需要較強(qiáng)的光照強(qiáng)度和較長的光照時(shí)間，才能滿足其生長發(fā)育的要求；而試驗(yàn)以及馴化過程中，在溫度水分各方面環(huán)境條件都優(yōu)于其生長的自然環(huán)境下，需要適當(dāng)降低光照強(qiáng)度，達(dá)到培養(yǎng)和馴化目的。試驗(yàn)培養(yǎng)過程中光照強(qiáng)度過高時(shí)，組培苗將出現(xiàn)葉片變白、莖段頂部褐化、植株停止生長并且死亡等現(xiàn)象。光照時(shí)間應(yīng)保持在12 h·d-1左右，當(dāng)光照時(shí)間低于12 h·d-1時(shí)，瓶苗得不到充分光照，生長緩慢，長勢較差；當(dāng)光照時(shí)間太長時(shí)，瓶苗正常生長代謝被破壞，生長也會受到影響。

3.3 污染的原因及解決方法

由于種子大、種皮厚且硬，去除種皮難，所以種皮內(nèi)的大量細(xì)菌和真菌就存活下來，直接導(dǎo)致污染。為解決這一污染現(xiàn)象，一種方法就是將已經(jīng)發(fā)芽的種子再進(jìn)行一次消毒，這樣雖然達(dá)到了消毒的目的，但會影響種子的活力。本試驗(yàn)采取的是常規(guī)方法與降低溫度的方法，將接種室溫度降至12 ℃左右，并在接種過程中，更加頻繁更換濾紙和進(jìn)行手術(shù)刀、鑷子和培養(yǎng)皿消毒，極大地降低污染率。更完善的方法還有待以后的進(jìn)一步研究。

3.4 褐化現(xiàn)象及解決方法

由于種子大，種皮厚，種皮帶紅色、褐色或黑色，黑色種臍包圍著種子的3/4，易出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，同時(shí)光強(qiáng)太強(qiáng)，培養(yǎng)苗易出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，即四周出現(xiàn)黑色小斑點(diǎn)，應(yīng)降低光強(qiáng)，褐化現(xiàn)象可以得到改善，所以在開始培養(yǎng)之前就應(yīng)將光強(qiáng)設(shè)置到適當(dāng)值；并進(jìn)行多次轉(zhuǎn)移后，褐化現(xiàn)象逐漸消失。