電擊法建立SD大鼠焦慮型心理應(yīng)激-失眠模型的研究

張曉婷，劉文超，劉俊昌，，李明星，郭 蕾，卡熱買提·阿布都克然木，張 赫，張新均

(1. 新疆醫(yī)科大學(xué)，新疆 烏魯木齊 830000；2. 新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院,新疆 烏魯木齊 830000)

心理應(yīng)激是指出乎意料的緊張情況所引起的一種特殊的情緒狀態(tài)，造成心理應(yīng)激的應(yīng)激源情緒包括焦慮、內(nèi)疚、恐懼、抑郁等，其中最常見的是焦慮[1]?，F(xiàn)代社會生活的高強(qiáng)度、快節(jié)奏造成了心理社會應(yīng)激的增加，而焦慮型心理應(yīng)激導(dǎo)致的負(fù)性情緒又是造成失眠的主要原因[2]。心理應(yīng)激及失眠發(fā)病率的逐年增高，已成為威脅人類健康的重要原因。然而目前失眠發(fā)生機(jī)制尚不完全明確，臨床治療失眠的方法復(fù)雜多樣且存在不同程度的不良反應(yīng)。故建立一種理想的焦慮型心理應(yīng)激-睡眠障礙動物模型，對于焦慮型失眠的研究有重要意義。嚙齒類動物焦慮樣行為與人類受累腦區(qū)相近，且人類抗焦慮藥物可改善嚙齒類動物行為學(xué)，說明嚙齒類動物焦慮樣行為的研究可以為人類的焦慮問題研究提供線索[3-4]。故本研究選擇SD大鼠進(jìn)行應(yīng)激動物模型的建立評價，探討其在科研領(lǐng)域的應(yīng)用價值。

1 實驗資料

1.1動物與分組 5周齡SPF級雄性SD大鼠26只，體質(zhì)量180～220 g，新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，許可證號：SCXK(新)2011-0004。實驗動物群養(yǎng)在大鼠通風(fēng)鼠籠中，每籠4～6只，實驗于新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心內(nèi)進(jìn)行，飼養(yǎng)房溫度20 ℃，濕度30%～60%，自由飲食，晝夜節(jié)律按照12 h明12 h暗進(jìn)行。實驗過程中對動物的處置謹(jǐn)遵我國科技部2006年頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》。動物適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，利用隨機(jī)數(shù)字表法產(chǎn)生隨機(jī)數(shù)，將26只大鼠隨機(jī)分為模型組14只(考慮電擊可能造成大鼠死亡，故適當(dāng)加大樣本量)和空白組12只。

1.2儀器與設(shè)備 電擊籠(烏魯木齊經(jīng)科興業(yè)生物科技有限公司制造)，大鼠通風(fēng)鼠籠(新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供)，單向接觸式交流調(diào)壓器(浙江振凱電源設(shè)備有限公司)，艾普瑞電子式節(jié)能定時器(深圳市艾普瑞電子有限公司)，自制曠場實驗敞箱(規(guī)格為 100 cm×100 cm×40 cm)，自制大鼠跳臺實驗相關(guān)儀器。

1.3實驗方法 將模型組大鼠放入電擊籠，每籠4～5只，除正常飼養(yǎng)外，采用不可逃避性足底電擊方法建立焦慮型心理應(yīng)激-失眠模型：選用25 V電壓，通電與間歇1∶5的電擊量，每天不定時剝奪大鼠睡眠時間2 h，共21 d；空白組大鼠正常飼養(yǎng)21 d，不做任何處理。

1.4觀察指標(biāo)

1.4.1體表特征及體質(zhì)量 每日觀察記錄大鼠的精神狀態(tài)、毛發(fā)、活動、體質(zhì)量、等。

1.4.2自主活動試驗 實驗結(jié)束后對2組大鼠進(jìn)行曠場實驗。將實驗敞箱置于隔音環(huán)境中，箱內(nèi)面及底面均為黑色，底面平均分為25個4 cm×4 cm小方格，箱內(nèi)溫度為( 20±0.5)℃。中央?yún)^(qū)正上方安置攝像頭，其視野能夠覆蓋整個敞箱內(nèi)部。實驗開始1 h前將大鼠搬進(jìn)測試室適應(yīng)環(huán)境，然后將大鼠放到實驗敞箱中央?yún)^(qū)固定位置，每次放置頭部固定朝向一側(cè)。測量指標(biāo)包括運(yùn)動總距離、中央?yún)^(qū)停留時間、中央?yún)^(qū)進(jìn)入次數(shù)、直立次數(shù)及理毛次數(shù)，隨后用75% 乙醇清潔箱內(nèi)環(huán)境，等乙醇揮發(fā)無味后再放入下一只。每只大鼠均進(jìn)行7次測定，每次3 min，根據(jù)穿越底面積格子數(shù)計算水平得分，根據(jù)直立次數(shù)計算垂直得分，并記錄修飾次數(shù)、排便次數(shù)。

1.4.3學(xué)習(xí)及記憶能力測試 曠場實驗結(jié)束后對2組大鼠進(jìn)行跳臺實驗。將2組大鼠逐一置于設(shè)有10 cm×10 cm絕緣平臺的電擊籠內(nèi)，適應(yīng)環(huán)境5 min，正式實驗時電擊籠被通以25 V交流電，受試大鼠受到電擊后將尋找跳臺來躲避電擊。將大鼠置入電擊籠內(nèi)開始計時，大鼠跳到絕緣平臺計時停止，該段時間為潛伏期；記錄3 min內(nèi)大鼠離開絕緣平臺的次數(shù)為錯誤次數(shù)。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。垂直得分、水平得分符合正態(tài)分布但方差不齊，排泄次數(shù)、修飾次數(shù)不符合正態(tài)分布，潛伏期數(shù)據(jù)不完全符合正態(tài)分布，故均采用兩獨(dú)立樣本秩和檢驗，以M(Q1，Q3)形式表示；錯誤次數(shù)符合正態(tài)分布且方差齊，故采用兩獨(dú)立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.12組大鼠體表特征及體質(zhì)量變化 2組大鼠實驗前均精神狀態(tài)良好，毛發(fā)白凈柔順有光澤，修飾行為次數(shù)適中，對刺激敏感，不易被激惹，排便次數(shù)適中。實驗過程中，空白組大鼠體表特征無明顯變化，體質(zhì)量穩(wěn)定增長；模型組2只大鼠咬導(dǎo)絲導(dǎo)致心搏驟停死亡脫落，其余大鼠全身皮毛疏松散亂、發(fā)黃干枯無光澤，眼色暗紅，修飾次數(shù)明顯增多，排便次數(shù)減少，并逐漸出現(xiàn)刺激過敏，警惕易驚、易激怒，好斗，相互追逐撕咬，且實驗1，2，3周體質(zhì)量均明顯低于同期空白組(P均<0.05)。見表1。

2.22組大鼠自主活動檢測情況 模型組大鼠垂直得分、水平得分均明顯高于空白組(P均<0.05)，修飾次數(shù)明顯多于空白組(P<0.05)，排泄次數(shù)2組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2及表3。

表1 2組大鼠實驗前后體質(zhì)量比較

注：①與空白組比較，P<0.05。

表2 2組大鼠自主活動測試垂直得分、水平得分比較分)

注：①與空白組比較，P<0.05。

表3 2組大鼠自主活動測試排泄次數(shù)、修飾次數(shù)比較 次

注：①與空白組比較，P<0.05。

2.32組大鼠學(xué)習(xí)及記憶能力比較 模型組大鼠潛伏期明顯長于空白組(P<0.05)，錯誤次數(shù)明顯多于空白組(P<0.05)。見表4。

表4 2組大鼠學(xué)習(xí)及記憶能力測試中潛伏期、錯誤次數(shù)比較

注：①與空白組比較，P<0.05。

3 討 論

人的一生有超過1/3的時間是在睡眠中度過的，睡眠對于動物包括人類的生命、生長具有不可或缺的重要生理意義。相關(guān)研究顯示，成人睡眠每天不足4 h者，其病死率是每天睡眠7～8 h者的1.8倍[5]。動物研究顯示，完全性睡眠剝奪可導(dǎo)致大鼠海馬和皮質(zhì)caspase-3表達(dá)增加，其增加程度與睡眠剝奪時間成正相關(guān)，而caspase-3表達(dá)增加被認(rèn)為是引起大鼠神經(jīng)元凋亡進(jìn)而影響大鼠記憶和認(rèn)知功能的重要機(jī)制之一[6]。

在醫(yī)學(xué)發(fā)展史上，睡眠障礙一直是備受關(guān)注的課題，針對其發(fā)生機(jī)制的研究顯示，心理應(yīng)激導(dǎo)致的負(fù)性情緒，包括焦慮、抑郁等是造成失眠率不斷增長的主要原因[7]，其公認(rèn)的病理生理基礎(chǔ)之一是下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸) 過于興奮和亢進(jìn)[8]。然而目前還沒有一種理想的焦慮型心理應(yīng)激-睡眠障礙模型，為了方便今后對該類睡眠障礙的研究，本課題組設(shè)計了電擊法建立SD大鼠焦慮型心理應(yīng)激-失眠模型的實驗。因為足底電擊應(yīng)激是經(jīng)典應(yīng)激方式的一種，廣泛地應(yīng)用于條件恐懼相關(guān)研究[9]，故本實驗基于電刺激引起的大鼠足部疼痛，進(jìn)而引起大鼠情緒焦慮，影響大鼠睡眠，而睡眠剝奪和情緒焦慮又可互為因果的生物行為模式，對大鼠進(jìn)行間歇性低電壓、不定時電刺激，另外根據(jù)大鼠晝伏夜出的生活節(jié)律[10]，電刺激選在白天進(jìn)行。又因為絕大多數(shù)焦慮型睡眠障礙患者并非完全睡眠剝奪，而是睡眠時間不足，不能滿足患者需求或睡眠時間顛倒，日常工作及生活受影響，為接近現(xiàn)實，故本實驗設(shè)計為剝奪大鼠部分睡眠。該造模實驗的優(yōu)點(diǎn)：①電擊大鼠足部制造大鼠失眠模型已經(jīng)有相關(guān)研究基礎(chǔ)作為支撐，確保了造模的有效性，而本實驗的優(yōu)勢在于化繁為簡，充分利用大鼠晝伏夜出的生活習(xí)性，進(jìn)行不定時電刺激，大鼠在白天的任何時間段都有可能遭受電擊，故而恐懼焦慮，無法安睡，減少了實驗所需的人力物力，降低了造模成本。②單一的造模方法可以減少多因素干擾，控制了研究變量。③與藥物造模相比，單純的物理刺激不僅可以減少對實驗動物機(jī)體的損害，還能控制化學(xué)反應(yīng)可能對實驗造成的誤差，并且更為安全，更容易操作。另外本實驗為了觀察大鼠的行為變化和學(xué)習(xí)記憶能力，分別進(jìn)行了曠場實驗和跳臺實驗，其中曠場實驗中動物行為發(fā)生的頻率和持續(xù)時間可反映實驗動物在陌生環(huán)境中的自主行為與探究行為[11-12]，跳臺實驗中潛伏期和錯誤次數(shù)可以反映實驗動物的學(xué)習(xí)能力和記憶能力[13]。

本實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠體質(zhì)量增長緩慢，大鼠在新環(huán)境中的自主行為增多，表現(xiàn)出焦慮不安、煩躁猶豫的特征，這都與焦慮癥的癥狀吻合；模型組大鼠排泄次數(shù)有減少，但與空白組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明模型組與空白組大鼠在新環(huán)境下的緊張度相近，也可能與模型組大鼠因焦慮失眠導(dǎo)致的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)功能紊亂有關(guān)，還可能與樣本量較小有關(guān)，需要進(jìn)一步驗證；但模型組大鼠修飾次數(shù)明顯多于空白組，說明模型組大鼠在新環(huán)境下更容易出現(xiàn)焦慮情緒；模型組大鼠垂直得分、水平得分均明顯高于空白組，但模型組垂直得分、水平得分標(biāo)準(zhǔn)差較大，說明個體之間存在較大差異，均數(shù)的代表性意義不強(qiáng)。跳臺實驗中，模型組大鼠潛伏期明顯延長，錯誤次數(shù)明顯增多，說明造模大鼠學(xué)習(xí)能力和記憶力下降，但模型組大鼠潛伏期標(biāo)準(zhǔn)差較大，說明個體之間存在較大差異，均數(shù)的代表性意義不強(qiáng)。

綜上所述，電擊法建立SD大鼠焦慮型心理應(yīng)激-失眠模型方法簡便、可靠、高效，可同時對多只大鼠進(jìn)行模型建立，該造模方法可應(yīng)用于探究焦慮型失眠的病因病機(jī)研究及判斷焦慮型失眠的療效。但由于多方面的原因，本實驗設(shè)計還存在一些不足，如樣本量較??；實驗設(shè)備相對簡陋，實驗記錄、統(tǒng)計、分析多數(shù)來自人工操作，主觀性較強(qiáng)；實驗沒有在明、暗兩種環(huán)境下進(jìn)行，存在選擇誤差；焦慮反應(yīng)和抑郁反應(yīng)二者之間往往有一個時間跨度，在短時間的應(yīng)激條件下動物以焦慮反應(yīng)為主，而長時間的應(yīng)激則會顯著增加抑郁情緒的成分[14-15]，時間跨度不易掌握。在今后的焦慮型心理應(yīng)激-失眠模型的研究中，可根據(jù)焦慮型失眠的流行病學(xué)特點(diǎn)，引入對雌性動物和幼年動物的研究；細(xì)化焦慮型心理應(yīng)激-失眠的臨床分型，有目標(biāo)性的研制動物模型；對目前存在的造模方式進(jìn)行系統(tǒng)評價，并進(jìn)行改良優(yōu)化，可提高模型制備實驗的準(zhǔn)確性、有效性和可重復(fù)性，從而為焦慮型心理應(yīng)激-失眠相關(guān)研究提供可靠的動物模型。