上海市鼠傷寒沙門菌單相變異株的鑒定和耐藥譜分析

吳 雯，屠麗紅，張?chǎng)┫?，?曦，陳 敏

（1. 上海市疾病預(yù)防控制中心，上海 200336；2. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 201203）

鼠傷寒沙門菌是引起食物中毒最常見的致病菌之一，也是重要的醫(yī)院感染致病菌[1]。20世紀(jì)90年代中期，泰國、西班牙等國家首先報(bào)道分離出鼠傷寒沙門菌單相變異株，該單相變異株是從鼠傷寒沙門菌進(jìn)化而來的[2-3]。單相變異株主要指Ⅱ相鞭毛抗原的缺失，可能的分子機(jī)制包括Ⅱ相鞭毛抗原編碼基因fljB缺失或相關(guān)的調(diào)控基因如fljA和hin等缺失導(dǎo)致其血清型由4，[5]，12：i：1，2變?yōu)?，12：i：-或4，5，12：i：-[4]。近年來，鼠傷寒沙門菌單相株在世界范圍內(nèi)迅速流行、暴發(fā)，多重耐藥不斷加劇，引發(fā)了嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題[5]。目前我國相關(guān)的報(bào)道較少，尚缺乏快速、有效的鑒定方法，故其流行情況、耐藥譜等長(zhǎng)期被忽視和低估[6]。本研究擬以上海市疾病預(yù)防控制中心細(xì)菌檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室收集的上海市流行的沙門菌為研究對(duì)象，應(yīng)用血清分型和分子生物學(xué)技術(shù)，鑒定鼠傷寒沙門菌單相變異株，探討其血清型、耐藥譜型和基因型特征。

1 材料和方法

1.1 菌株和試劑

1.1.1 菌株 沙門菌由上海市疾病預(yù)防控制中心細(xì)菌檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室從腹瀉患者糞便樣本中分離并保存，鼠傷寒沙門菌標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC 202165）由上海市疾病預(yù)防控制中心菌毒種保藏中心保存。

1.1.2 試劑和培養(yǎng)基 沙門菌顯色培養(yǎng)基、水解酪蛋白胨培養(yǎng)基由上海市疾病預(yù)防控制中心培養(yǎng)基室配置。沙門菌診斷血清和誘導(dǎo)瓊脂購自丹麥國家血清研究所?？咕幬锼幬锩舾行约埰退饫业鞍纂谁傊徸杂鳲xoid公司，所有引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增試劑Premix taq、DL 2000 DNA marker購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 鼠傷寒沙門菌單相株鑒定

將2013—2015年上海市疾病預(yù)防控制中心細(xì)菌檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室收集的1 179株沙門菌進(jìn)行復(fù)蘇，分別進(jìn)行PCR鑒定和血清分型。

1.2.1 PCR鑒定 采用煮沸裂解法獲取沙門菌核酸，PCR擴(kuò)增鼠傷寒沙門菌及其單相變異株共有的特異性基因片段fliB-fliA基因間區(qū)，引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系為： 2×Premix taq 12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，模板DNA 1 μL，用無菌雙蒸水補(bǔ)至25 μL。PCR反應(yīng)條件見表1。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。擴(kuò)增片段大小為964 bp的菌株是鼠傷寒沙門菌，擴(kuò)增片段缺失或大小不符為其他血清型沙門菌。

表1 引物序列和PCR反應(yīng)條件

1.2.2 血清分型 采用玻片凝集實(shí)驗(yàn)對(duì)菌株進(jìn)行血清分型的復(fù)核，依據(jù)White-Kauffman-Le Minor抗原表，記錄完整的抗原式，將血清型為4，5，12：i：1，2或者4，12：i：1，2的菌株記錄為鼠傷寒沙門菌，對(duì)于連續(xù)誘導(dǎo)3次后仍然缺失Ⅱ相鞭毛抗原的鼠傷寒沙門菌，記錄血清型為4，5，12：i：-或4，12：i：-。 血清型符合4，[5]，12：i：- 且fliB-fliA基因間區(qū)擴(kuò)增片段大小為964 bp的菌株為鼠傷寒沙門菌單相株，統(tǒng)計(jì)分析2013—2015年上海市鼠傷寒沙門菌單相變異株的流行特征。

1.3 鼠傷寒沙門菌單相株基因特征研究

以鼠傷寒沙門菌單相株的核酸為模板，以鼠傷寒沙門菌標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC 202165）為陽性對(duì)照，PCR擴(kuò)增fljA、fljB和hin基因，引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系為： 2×Premix taq 12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，模板DNA 1 μL，用無菌雙蒸水補(bǔ)至25 μL，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。見表1。

1.4 藥物敏感性試驗(yàn)

藥物敏感性試驗(yàn)采用世界衛(wèi)生組織推薦的改良紙片擴(kuò)散法，依據(jù)2016年美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）指南進(jìn)行操作和結(jié)果判讀。所選用的抗菌藥物包括頭孢西?。╟efoxitin，F(xiàn)OX）、頭孢噻肟（cefotaxime，CTX）、頭孢呋辛（cefuroxime，CXM）、慶大霉素（gentamicin，GN）、氨芐西林（ampicillin，AMP）、萘啶酸（nalidixic acid，NAL）、環(huán)丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、左氧氟沙星（levofloxacin，LEV）、諾氟沙星（norfloxacin，NOR）、氯霉素（chloramphenicol，C）、四環(huán)素（tet racycli ne，TE）、鏈霉素（streptomycin，S）、磺胺異噁唑（sulfasoxazole，SF）和復(fù)方磺胺甲噁唑（sulfamethoxazoletrimethoprim，SXT）14種。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。耐藥率比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2013—2015年上海市鼠傷寒沙門菌單相變異株檢出情況

1 179株沙門菌中共分離出單相變異株52株，分別占所有沙門菌和鼠傷寒沙門菌的4.4%和23.3%。進(jìn)一步分析這些單相變異株的宿主信息，發(fā)現(xiàn)31株（59.6%）單相變異株的宿主來源于15～60歲的青中年人群，9株（17.3%）來源于 0～15歲的少兒人群，12株（23.1%）來源于＞60歲的老年人群；宿主性別分析顯示28株（53.8%）檢出于男性，24株（46.2%）檢出于女性；地域分布信息分析顯示40株（76.9%）的宿主來源為上海郊區(qū)，12株（23.1%）的宿主來來源為上海市區(qū)。

2.2 鼠傷寒沙門菌單相株血清型特征和基因特征

血清分型結(jié)果顯示52株鼠傷寒沙門菌單相變異株的血清型均為4，5，12：i：-，無4，12：i：-血清型。采用PCR檢測(cè)52株單相變異株中fljB，fljA和hin基因的表達(dá)情況。通過統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，f l jB基因缺失株有44株，占84.6%。進(jìn)一步檢測(cè)fljB基因未缺失的8株單相變異株的fljA和hin基因后發(fā)現(xiàn)有2株fljA和hin基因同時(shí)缺失，另外6株均檢測(cè)到f l jA和hin基因。

2.3 鼠傷寒沙門菌單相株對(duì)14種抗菌藥物的敏感性

鼠傷寒沙門菌單相株中有3株對(duì)14種抗菌藥物均敏感。有40株多重耐藥，其中有36株（69.23%）耐4類以上抗菌藥物，有13株（25%）耐6～7類抗菌藥物。見圖1。

圖1 52株鼠傷寒沙門菌單相株對(duì)常用抗菌藥物的耐藥譜分析

從2013—2015年上海市疾病預(yù)防控制中心保存的沙門菌中每年分別隨機(jī)抽取22株共66株鼠傷寒沙門菌雙相株（4，[5]，12：i：1，2）作為對(duì)照，采用上述方法檢測(cè)耐藥譜。將2013—2015年的單相株與雙相株的耐藥結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在單相株和雙相株中分別有76.92%和48.48%的菌株耐3類以上抗菌藥物。耐藥譜中，雙相株和單相株對(duì)AMP、SF、S、TE、NAL和C均表現(xiàn)出較高的耐藥性，但單相株對(duì)氨芐西林-鏈霉素-磺胺類藥-四環(huán)素（ampicillin-streptomycin-sulfonamidetetracycline，ASSuT）或青霉素-氯霉素-鏈霉素-磺胺類藥-四環(huán)素（ampicillin-chloramphenicolstreptomycin-sulfonamide-tetracycline，ACSSuT）的耐藥率遠(yuǎn)高于雙相株（P＜0.05）。見表2。

表2 2013—2015年鼠傷寒沙門菌單相株和雙相株耐藥率比較 （%）

3 討論

近十年來，國外文獻(xiàn)報(bào)道鼠傷寒沙門菌單相變異株在動(dòng)物和人群中快速傳播，在引起感染的沙門菌血清型中比例大幅上升[7]，造成了多起食源性疾病的暴發(fā)[8]，同時(shí)，鼠傷寒沙門菌單相變異株也是引起醫(yī)院交叉感染的重要致病菌之一[9]。在我國，關(guān)于鼠傷寒沙門菌單相變異株的報(bào)道較少。為獲得上海市鼠傷寒沙門菌單相變異株的流行情況、表型及基因型和耐藥譜等基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，本研究結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)和血清分型的方法，對(duì)2013—2015年上海市流行的沙門菌進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，鼠傷寒沙門菌單相變異株在所有血清型沙門菌和鼠傷寒沙門菌中的構(gòu)成比分別為4.4%和23.3%。這些病例主要以青中年人群為主，且主要分布在郊區(qū)，提示這可能與中青年人群的飲食習(xí)慣差于青少年及老年人群，郊區(qū)人群的衛(wèi)生意識(shí)等弱于市區(qū)人群有關(guān)。

目前，關(guān)于我國鼠傷寒沙門菌單相變異株的報(bào)道較少的原因比較復(fù)雜，可能與傳統(tǒng)血清分型方法受到誘導(dǎo)次數(shù)、誘導(dǎo)瓊脂、誘導(dǎo)血清等多種因素的影響有關(guān)。另外，檢測(cè)工作量大、工作時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員技術(shù)要求高導(dǎo)致記錄不完整或命名混亂等也是原因之一。眾多因素導(dǎo)致部分單相變異株漏檢，影響到對(duì)該單相變異株的防控與治療。本研究檢出的52例鼠傷寒沙門菌單相變異株的血清型均為4，5，12：i：-，無4，12：i：-血清型。在鼠傷寒沙門菌中，有Ⅰ相和Ⅱ相鞭毛素編碼基因分別位于染色體不同的部位，常以fliC和fljB分別表示。最初認(rèn)為鼠傷寒沙門菌單相變異株是由fljB基因的缺失引起，在采用血清型方法進(jìn)行鑒定時(shí)，由于存在上述多種因素的影響，歐洲食品安全局建議采用PCR擴(kuò)增鼠傷寒沙門菌特異性片段fliB-fliA基因間區(qū)并以缺失fljB基因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)來判定鼠傷寒沙門菌單相變異株[10]。但之后的研究發(fā)現(xiàn)部分鼠傷寒沙門菌單相變異株不缺失fljB基因。本研究結(jié)合傳統(tǒng)的血清學(xué)鑒定方法和fliB-fliA基因間區(qū)PCR鑒定方法來檢測(cè)鼠傷寒沙門菌單相變異株，共鑒定出52株單相變異株。進(jìn)一步通過對(duì)鞭毛抗原編碼基因的檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)有44株（84.6%）為fljB基因缺失型，與文獻(xiàn)報(bào)道的部分鼠傷寒沙門菌單相變異株仍然含有完整的fljB基因結(jié)果相一致，提示在我國也存在fljB基因不缺失的鼠傷寒沙門單相株，因此不建議單純依賴fljB基因檢測(cè)來判定單相變異株。在Ⅱ相鞭毛素編碼基因fljB的下游緊鄰一個(gè)被稱為fljA的特殊基因，與fljB構(gòu)成同一基因簇fljBA，在fljBA的上游，存在一個(gè)編碼重組酶的hin基因，影響f l jBA啟動(dòng)區(qū)域方向的正確性，如“開關(guān)”一樣控制fljBA的表達(dá)[11]，fljA和hin等調(diào)控基因可能參與了鼠傷寒沙門菌單相突變的發(fā)生。本研究對(duì)8株fljB基因未缺失的單相變異株進(jìn)行fljA和hin基因檢測(cè)，其中有2株同時(shí)缺失fljA和hin基因，還有6株菌fljA和hin基因均未缺失，提示可能存在其他更復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制引起Ⅱ相鞭毛素編碼基因缺失[12]。

耐藥率升高和多重耐藥是鼠傷寒沙門菌單相變異株對(duì)人類健康的另一大威脅[13]。本研究結(jié)果顯示鼠傷寒沙門菌單相變異株有著較高的耐藥率，進(jìn)一步的耐藥譜分析結(jié)果顯示上海地區(qū)的耐藥譜與發(fā)達(dá)國家的耐藥譜相似，以ASSuT四重耐藥為典型，遠(yuǎn)高于鼠傷寒沙門菌雙相株（P＜0.05），該數(shù)據(jù)也與我國關(guān)于食物中分離的鼠傷寒沙門菌單相變異株耐藥特點(diǎn)相符[14]。本研究的結(jié)果同時(shí)顯示多重耐藥尤其是耐4類以上抗菌藥物的鼠傷寒沙門菌單相株比例在ASSuT耐藥的基礎(chǔ)上，又增加了臨床常見藥物NAL和C等，這提示上海地區(qū)對(duì)單相變異株的防控形勢(shì)更加嚴(yán)峻。這些多重耐藥單相變異株的出現(xiàn)帶來了較大的醫(yī)療負(fù)擔(dān)和健康危害，同時(shí)鼠傷寒沙門菌單相變異株作為寬宿主范圍血清型，可以廣泛感染動(dòng)物和人，對(duì)公共衛(wèi)生安全造成較大危害。針對(duì)這些問題，上海市各級(jí)衛(wèi)生機(jī)構(gòu)應(yīng)加強(qiáng)對(duì)鼠傷寒沙門菌單相變異株的監(jiān)測(cè)，了解其耐藥譜的變遷情況，為臨床醫(yī)生提供預(yù)防和治療感染的合理方案，這具有非常重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

綜上所述，通過對(duì)2013—2015年上海市鼠傷寒沙門菌單相變異株的分析，本研究獲得了上海市鼠傷寒沙門菌單相變異株的流行背景信息、血清型和基因型特征，其地域分布及年齡分布結(jié)果提示在未來的疾病防控中應(yīng)以郊區(qū)人群及青中年人群為重點(diǎn)防控對(duì)象。沙門菌監(jiān)測(cè)人員要重視這類血清型，規(guī)范記錄。單相變異株部分基因的缺失及表達(dá)，給進(jìn)一步的機(jī)制研究提供了重要數(shù)據(jù)，并有助于研制有針對(duì)性的疫苗和治療藥物。在臨床對(duì)抗菌藥物的使用中，4類以上藥物耐藥菌是重點(diǎn)監(jiān)測(cè)對(duì)象，本研究為臨床用藥提供了重要的參考。在以后的工作中，應(yīng)每年針對(duì)鼠傷寒沙門菌單相變異株進(jìn)行類似研究，關(guān)注其流行趨勢(shì)，以有效防控。