甘草內(nèi)生細菌對4種植物病原菌的抑菌譜及其16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育分析

祖麗皮亞木·木沙爾,李 麗,郭建偉,3,古麗斯瑪依·艾拜都拉,OSAMA Mohamed,4

(1.新疆大學 生命科學與技術(shù)學院 新疆資源微生物實驗室，烏魯木齊 830046；2.中國科學院 新疆生態(tài)與地理研究所 干旱區(qū)生物地理與生物資源重點實驗室，烏魯木齊 830011；3.紅河學院 云南省高校農(nóng)作物優(yōu)質(zhì)高效栽培與安全控制重點實驗室，云南蒙自 661100；4.Environmental Science Department,Institute for Postgraduate Environmental Studies,Suez Canal University,El-Arish Branch,North Sinai 45511,Egypt)

植物內(nèi)生細菌主要存在于植物細胞內(nèi)或細胞間隙，不易受環(huán)境的干擾，因此與其他生物防治因子相比，具有較大的優(yōu)勢；對寄主植物具有抗病蟲害、促生、內(nèi)生固氮、殺線蟲等多種作用[1]。2007年，龔明福等[2]從烏拉爾甘草獲得125株內(nèi)生細菌，以對峙培養(yǎng)法篩選出31株對棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、棉花黃萎病菌(Verticilliumdahliae)具有較強拮抗活性的菌株；饒小莉等[3]從烏拉爾甘草中分離到98株內(nèi)生菌，并采用平板對峙法篩選出6株對棉花枯萎病菌(F.oxysporum)等8株植物病原菌具有拮抗活性的菌株。此外，程曉燕等[4]以免培養(yǎng)法對150個克隆測序發(fā)現(xiàn)32個分類單元，其中歸屬于變形菌門(Proteobacteria)的alpha、gamma亞群、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)中的鞘脂菌屬(Sphingobium)、葉桿菌屬(Phyllobacterium)、生絲單胞菌屬(Hyphomonas)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)等14個屬，其中，26%的克隆與已知細菌16S rDNA基因相似性小于96%，代表潛在的新分類單元。由此可見，甘草中具有豐富的內(nèi)生細菌資源，并且其內(nèi)生細菌中存在豐富的植物病原真菌拮抗菌株資源。本研究擬從100株甘草內(nèi)生細菌中篩選出對石榴枯萎病甘薯長喙殼等4種植物病原真菌有抑制作用的菌株，以期為甘草內(nèi)生細菌的應用開發(fā)提供潛在生防菌資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 供試病原菌：石榴枯萎病菌甘薯長喙殼YP-1(CeratocystisfimbriataEllis and Halsted,縮寫為Cf YP-1)、草果假莖黑斑病小孢擬盤多毛孢菌CGJ-1(Pestalotiopsismicrospore,縮寫為Pm CGJ-1)、 草果葉斑病鐮刀菌 Ayb-3(Fusariumsp,縮寫為F Ayb-3)、 墨蘭炭疽病膠胞炭疽菌 ML-2(ColletotrichumgloeosporioidesAllesch,縮寫為Cog ML-2)共4種植物病原菌，均由云南紅河學院云南省高校農(nóng)作物優(yōu)質(zhì)高效栽培與安全控制重點實驗室提供。

供試甘草內(nèi)生細菌：100株甘草內(nèi)生細菌由中國科學院新疆生態(tài)與地理研究所特殊環(huán)境微生物實驗室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 酵母-麥芽膏培養(yǎng)基(ISP 2)：酵母膏 4.0 g， 葡萄糖 4.0 g， 麥芽膏 5.0 g，微量鹽溶液 1 mL，瓊脂 15.0 g，水 1 000 mL，pH 7.0～7.2。

馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 17 g，水 1 000 mL，pH 自然。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌、甘草內(nèi)生細菌的活化 將4種病原真菌分別接在PDA和ISP 2平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，待菌絲長滿平板后轉(zhuǎn)4 ℃冰箱保存，備用。將純化的甘草內(nèi)生細菌接種于ISP 2平板，30 ℃ 恒溫培養(yǎng)。

1.2.2 拮抗菌株的篩選 供試細菌拮抗作用的初步篩選采用平板對峙培養(yǎng)法。以Cf YP-1作為供試病原菌，接種于ISP 2平板中央，用接種環(huán)挑取內(nèi)生細菌點接在距平板中央3 cm處的4個角點上，以僅接病原真菌的平板作為對照，每處理設(shè)3次重復。28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，觀察內(nèi)生細菌對病原真菌的拮抗作用，測定病原菌菌落擴展半徑并計算其相對抑菌率。

I= (R0-Ri)/R0×100%。

式中：I代表相對抑菌率，R0代表對照組病原菌菌落的擴展半徑，Ri代表試驗組病原菌菌落的擴展半徑。

根據(jù)初步篩選試驗結(jié)果篩選出相對抑菌率大于10%的菌株，對其采用平板對峙培養(yǎng)法在 PDA 平板上再次篩選，每處理設(shè)3次重復。

1.2.3 拮抗菌株抑菌譜的測定 以Pm CGJ-1、F Ayb-3、Cog ML-2為供試病原菌，采用平板對峙培養(yǎng)法，以不接種目的細菌作為對照，于28 ℃下恒溫培養(yǎng)5～7 d后測定病原菌菌落的擴展半徑并計算其相對抑菌率。

1.2.4 拮抗菌株的鑒定 采用細菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)，1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)測定菌株的16S rRNA基因序列。反應體系(50 μL)：10 × EasyTaqBuffer(Mg2+2 mmol·L-1) 5.0 μL、dNTPs(2.5 mmol·L-1)4.0 μL、引物27F (10 pmol·L-1) 1 μL，引物1492R (10 pmol·L-1) 1 μL、EasyTaqDNA酶(5 U·μL-1) 0.5 μL，Template DNA 2 μL、用ddH2O補足至50 μL。PCR反應程序：預變性95 ℃ 5 min；變性95 ℃ 1 min，退火55 ℃ 1 min，延伸72 ℃ 2 min(30個循環(huán))；延伸72 ℃ 10 min。根據(jù)測序結(jié)果，在Ezbiocloud ( EzTaxone server)和BLAST對其進行在線序列比對并確定菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位，最后利用MEGA 6.0軟件構(gòu)件系統(tǒng)發(fā)育樹。序列測定委托生工生物工程股份有限公司完成。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 采用單因素方差分析比較不同菌株病原菌拮抗活性之間的差別，從而檢驗不同菌株拮抗活性之間的差別是否有統(tǒng)計學意義，病原菌菌落擴展半徑為3次重復試驗的平均值，統(tǒng)計分析利用SPSS 16. 0軟件進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌株的篩選

測定100株甘草內(nèi)生細菌對石榴枯萎病菌甘薯長喙殼的拮抗能力，為排除一些人為誤差，以相對抑菌率超過10%認為有抑菌作用，結(jié)果表明有61株菌對石榴枯萎病菌有抑制作用。 從甘草內(nèi)生細菌對石榴枯萎病菌的拮抗能力測定結(jié)果可知(表1) ，61株拮抗菌中，拮抗能力強的菌株有13個，占拮抗菌株總數(shù)的21%，菌株號分別為G010、G012、G033、G038、G039、G046、G050、G057、G072、G092、G101、G124和G127，抑菌半徑均超過15 mm。拮抗能力中等的和能力弱的菌株分別有36株和12株，分別占拮抗菌株總數(shù)的59%和20%。

2.2 13株強拮抗性菌株抑菌譜的測定

13株強拮抗性甘草內(nèi)生細菌對不同病原菌的抑菌作用測試結(jié)果表明，它們不僅對石榴枯萎病菌YP-1有抑制作用，而且對草果假莖黑斑病菌CGJ-1、墨蘭膠胞炭疽菌ML-2及草果葉斑病菌Ayb-3都有一定的抑制作用，表現(xiàn)出抑菌廣譜性，這些病原菌包括半知菌類的擬盤多毛孢屬、炭疽菌屬和鐮刀菌屬。

從13株菌對石榴枯萎病菌YP-1的抑菌半徑來看，菌株G127與其他菌株之間有顯著性差異，其抑菌半徑達(18.54±0.48) mm；然而其余菌株彼此之間均無顯著差異，抑菌半徑為(13.68±0.89)～(15.45±0.75)mm(表2)。

表1 61株拮抗性菌株對石榴枯萎病菌的抑菌作用Table 1 Inhibition activities of 61 endophytic bacterias isolated from Glycyrrhiza against pomegranate wilt pathogen

注：Yp-1表示石榴枯萎病甘薯長喙殼。抑菌半徑為5.00～10.00 mm：“+”即弱；10.00～15.00 mm：“++”即中；15 mm以上：“+++”即強 。

Note: Yp-1 indicatesCeratocystisfimbriataEllis and Halsted. In inhibition zone width of 5.00-10.00 mm,“+”means weak ,in width of 10.00-15.00 mm,“++”means medium，width of >15 mm,“+++” means strong.

菌株G057、G124、G127對草果假莖黑斑病菌CGJ-1 的抑制能力相比其他菌株較高，而彼此之間差異不顯著，其抑菌半徑達(20.38±1.24)～(21.27±0.86)mm；菌株G012 與G039與其他菌株間的抑菌能力差異顯著，其抑菌半徑分別為(15.88±0.39) mm、(17.15±1.06) mm。

13株菌對墨蘭炭疽菌ML-2的抑菌作用中，G038、G050、G092等3株菌對此病原菌無抑制作用；菌株G057與其他菌株間差異顯著，抑制能力較強，抑菌半徑達(20.70±0.21) mm；菌株G033、G039、G046、G101、G127的抑菌半徑達(17.97±1.11)～(18.95±0.93)mm，彼此之間差異不顯著，但與其他8株菌(抑菌半徑均等于或小于16.46 mm±0.53 mm)的抑菌能力差異顯著(表2)。

13株菌對草果葉斑病鐮刀菌 Ayb-3 的抑菌作用中，菌株G057與其他菌株間差異顯著，抑菌半徑達(25.17±1.03) mm；菌株G010、G012、G033、G038、G050、G092、G101、G124、G127的抑菌能力相當(P>0.05)，抑菌半徑在(20.16±0.38)～(22.31±0.44)mm；菌株G046的抑菌半徑為(22.98±0.74) mm，與G092、G101、G124差異顯著(表2)。

表2 13株強拮抗性菌株抑菌譜的測定Table 2 Determination of antifungal spectrum of 13 strong antagonistic strains

注：表中值為“平均值±標準偏差”。同列數(shù)字后面小寫字母不相同表示處理間在0.05水平上差異顯著，同行數(shù)字后面的大寫字母不相同表示處理間在0.05水平上差異顯著(P<0.05)。YP-1表示石榴枯萎病菌甘薯長喙殼，CGJ-1表示草果莖斑病小孢擬盤多毛孢菌，Ayb-3表示草果葉斑病鐮刀菌，ML-2表示墨蘭膠胞炭疽菌。

Note:Data are “means± SE”.The lowercase letters in the same columns mean significant difference at 0.05 level,different uppercase letters in the same rows mean significant difference at 0.05 level (P<0.05).YP-1 representsCeratocystisfimbriataEllis and Halsted,CGJ-1 representsPestalotiopsismicrospore,Ayb-3 representsFusariumsp ML-2 representsColletotrichumgloeosporioidesAllesch f.cymbidiiAllesch.

13 株菌株對同一種病原菌的抑制能力不同之外，同種甘草內(nèi)生細菌對不同病原菌的抑制能力也不同。菌株G012、G033、G039、G046、G057、G101對石榴枯萎病菌YP-1、草果莖斑病菌CGJ-1和墨蘭炭疽菌ML-2的抑菌半徑差異顯著，而對草果莖斑病菌CGJ-1和草果葉斑病鐮刀菌 Ayb-3的抑菌半徑差異不顯著；菌株G072、G124、G127對石榴枯萎病菌YP-1和草果莖斑病菌CGJ-1的抑菌半徑差異顯著，而對石榴枯萎病菌YP-1和墨蘭炭疽菌ML-2的抑菌半徑差異不顯著；同理，菌株G092對石榴枯萎病菌YP-1、草果莖斑病菌CGJ-1的抑菌半徑差異顯著，而對草果莖斑病菌CGJ-1和草果葉斑病鐮刀菌Ayb-3的抑菌半徑差異不顯著；菌株G010對石榴枯萎病菌YP-1、草果莖斑病菌CGJ-1、草果葉斑病鐮刀菌Ayb-3的抑菌半徑差異顯著，而對石榴枯萎病菌YP-1和墨蘭炭疽菌ML-2的抑菌半徑差異不顯著(表2)。

2.3 13株強拮抗性菌株的鑒定

16S rRNA基因序列測定結(jié)果表明(表3)，這13株菌分別屬于2個屬的3個種。其中，菌株G012為微桿菌屬的副氧化微桿菌(Microbacteriumparaoxydans)(圖1)，而菌株G046為芽孢桿菌屬的莫哈韋芽胞桿菌(B.mojavensis)(圖2)，序列相似性分別為99.78%和99.85%。菌株G010、G033、G038、G039、G050、G057、G072、G092、G101、G124、G127被鑒定為芽孢桿菌屬的萎縮芽孢桿菌(Bacillusatrophaeus)，序列相似性為99.93%(圖2)。

3 討論與結(jié)論

平板對峙法篩選拮抗菌操作簡便，直觀，成本低，是一種體外有效篩選拮抗菌的方法。Pilar等[5]發(fā)現(xiàn)熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)PICF7不但能在橄欖樹中定殖還能在根莖葉中遷移，定殖后對橄欖黃萎病表現(xiàn)出很強的抗菌活性；劉霞等[6]從陜北野生甘草內(nèi)生菌中分離到的12株內(nèi)生細菌發(fā)酵液對7種植物病原真菌菌絲均有不同程度的抑制作用，其中菌株號為X6的菌株對番茄灰霉病菌的抑制率高達90.67%。上述結(jié)果表明篩選植物病原菌拮抗性內(nèi)生菌時可以從不同種植物中進行。本研究從100株甘草內(nèi)生細菌中篩選出對石榴枯萎病有高拮抗活性的菌株13個，這與劉建利等[7]從寧夏烏拉爾甘草不同組織部位分離的151株內(nèi)生細菌具有8株對4種甜瓜采后病害病原菌均具有較高抑菌能力菌株的研究結(jié)果類似，這些研究成果說明甘草內(nèi)生細菌是許多未知植物病原菌的拮抗菌種庫。

表3 13株強拮抗性菌株的鑒定結(jié)果Table 3 Identification results of 13 strong antagonistic strains

圖1 強拮抗性菌株G012系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建Fig.1 Construction of phylogenetic tree of strong antagonistic strain G012

王美琴等[8]對分離自番茄的374株菌進行抑菌測定試驗，發(fā)現(xiàn)有20株菌對番茄灰霉病菌和葉霉病菌都具有抗菌活性，并且多數(shù)菌株對灰霉病菌有強拮抗作用而只有1株菌對葉霉病菌有強拮抗作用。本研究中篩選到的13株菌對不同病原菌的抗菌作用也有差異，如菌株G038對4種病原菌拮抗作用之間均有差異(表 2)，而菌株G127對石榴枯萎病菌YP-1和墨蘭炭疽菌ML-2的抑制能力差異不顯著，這表明同一株菌對不同病原菌的抗菌作用也可能不同。

圖2 12株強拮抗性菌株系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建Fig.2 Construction of phylogenetic tree of 12 strong antagonistic strains

芽孢桿菌屬(Bacillus)是組成植物微生態(tài)體系的優(yōu)勢種，由于具有抗菌譜廣、抗逆性強等特點而被看作為理想的生防細菌來源之一，因而較多的應用于農(nóng)作物病害的生物防治中。崔鄭龍等[9]對分離自烏拉爾甘草的11株內(nèi)生細菌進行棉花枯萎病拮抗菌株的篩選試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有2株菌對該病害表現(xiàn)出強拮抗活性，并對其進行16S rDNA 測序得知該菌株分別為解淀粉枯草芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)和特基拉芽孢桿菌(B.tequilensis)。本研究得到的13株強拮抗性菌株屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)和微桿菌屬(Microbacterium)，其中12株菌為芽孢桿菌屬(Bacillus)，該結(jié)果與前人研究是類似的，進一步表明芽孢桿菌屬是重要的植物病原菌拮抗菌類群。

在篩選拮抗菌時，供試細菌與供試病原真菌之間均產(chǎn)生較為明顯的抑菌圈，這說明可能是在細菌的代謝過程中產(chǎn)生具有抑菌活性的物質(zhì)，并進一步抑制病原真菌菌絲生長。但是拮抗細菌的抑菌機制比較復雜，而且拮抗細菌的田間生防效果還受到拮抗細菌寄主上的定殖率、土壤微生物等[10-11]因素影響，因此本試驗中拮抗性菌株抑菌機制及定殖率的研究是進一步挖掘其生防潛力的新目標。

植物內(nèi)生菌存在于植物細胞或細胞內(nèi)相對穩(wěn)定的環(huán)境系統(tǒng)中，相比根際菌株所受的外界干擾較少；植物內(nèi)生細菌繁殖快，易于培養(yǎng)，在植物體內(nèi)占據(jù)一定的生態(tài)位，并能與病原菌競爭生存空間而發(fā)揮生防作用[1]，這些特點決定植物內(nèi)生細菌在工農(nóng)業(yè)發(fā)展中的潛在應用價值。農(nóng)藥及化肥引起的一系列環(huán)境問題的出現(xiàn)，生防菌株的發(fā)現(xiàn)以及內(nèi)生菌控制植物病害途徑的多樣化加快生態(tài)型農(nóng)業(yè)的發(fā)展，利用這些生防菌開發(fā)微生物菌劑、微生物菌肥，替代或減少農(nóng)藥、化肥的使用，提高農(nóng)作物產(chǎn)量的同時有利于保護瀕危藥用植物資源，還可保持和豐富植物微生態(tài)系統(tǒng)的物種多樣性。