原位惡性黑素瘤單細(xì)胞分離及拉曼光譜測定

彭洋 陳挺杰 張婧秋 樊姣榮 朱佳 丁曉嵐 李航

100034北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚科 皮膚病分子診斷北京市重點實驗室（彭洋、陳挺杰、張婧秋、李航）；北京大學(xué)微電子學(xué)系微米/納米加工技術(shù)國家級重點實驗室（樊姣榮、朱佳）；北京大學(xué)人民醫(yī)院皮膚科（丁曉嵐）

惡性黑素瘤（簡稱惡黑）發(fā)病率逐年升高，侵襲性強、病死率高，嚴(yán)重威脅患者健康和生命[1]，根據(jù)侵襲程度可分為原位惡黑和侵襲性惡黑[2]。早期診斷、早期治療能夠顯著改善惡黑患者的預(yù)后[3?5]。早期原位惡黑細(xì)胞在表皮基底層散在增生，不呈巢，因此通過消化原位惡黑標(biāo)本分離所得的細(xì)胞混懸液所含黑素瘤細(xì)胞比例較低，尚需進一步純化才能獲得可供研究的高濃度黑素瘤細(xì)胞。黑素來源細(xì)胞（黑素瘤細(xì)胞、黑素細(xì)胞）在細(xì)胞懸液狀態(tài)下的形態(tài)特征，如細(xì)胞直徑、胞質(zhì)顆?；潭龋垂忡R下的胞質(zhì)非均質(zhì)化程度，可能與細(xì)胞內(nèi)色素顆粒、黑素小體、細(xì)胞代謝過程中的產(chǎn)物、細(xì)胞器等結(jié)構(gòu)有關(guān)）與其他來源的細(xì)胞是否存在差異，目前尚缺乏此類研究。本研究使用標(biāo)準(zhǔn)化試劑盒消化原位惡黑標(biāo)本獲得的細(xì)胞混懸液，嘗試依據(jù)細(xì)胞的大小、形態(tài)、胞質(zhì)成分、顆?；潭鹊戎笜?biāo)的差異，區(qū)分角質(zhì)形成細(xì)胞與黑素（瘤）細(xì)胞，并據(jù)此探索一套分離、純化原位惡黑中活性黑素（瘤）細(xì)胞的技術(shù)平臺，為后續(xù)從單細(xì)胞層次研究原位惡黑相關(guān)的發(fā)病機制、細(xì)胞學(xué)改變以及新的鑒別診斷指標(biāo)提供新線索。

一、對象與方法

1.對象：北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚科2015年10月至2016年4月確診的9例原位惡黑、5例侵襲性惡黑以及5例交界痣患者?；颊呔邮芰嗽l(fā)灶切除手術(shù)，腫瘤標(biāo)本行組織病理檢查。本研究通過北京大學(xué)第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（批號：2014[702]），患者均簽署知情同意書。

2.細(xì)胞系與試劑：黑素細(xì)胞系（PIG1）由美國Loyola University的Caroline Le Poole教授饋贈，惡黑細(xì)胞系（A375）由北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院腎癌與黑色素瘤科郭軍、孔燕、斯璐教授饋贈，永生化角質(zhì)形成細(xì)胞系（HaCaT）由北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚科吳艷教授饋贈。胎牛血清、青鏈霉素、HMGS、Medium 254培養(yǎng)基（美國Gibco公司），DMEM培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液（PBS，美國HyClone公司），臺盼藍(lán)（美國Sigma公司），RECELL表皮細(xì)胞分離試劑盒（澳大利亞Avita公司），S100抗體、AE1/AE3抗體、Melan?A抗體、山羊抗小鼠IgG抗體（美國OriGene公司），羊血清工作液、二氨基聯(lián)苯胺顯色液（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

3.細(xì)胞培養(yǎng)：A375細(xì)胞與PIG1細(xì)胞分別在含10%胎牛血清、1%青鏈霉素、1%HMGS的Medium 254培養(yǎng)基中，37℃、100%濕度、5%CO2條件下培養(yǎng)。HaCaT細(xì)胞于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，37℃、100%濕度、5%CO2條件下培養(yǎng)。

4.細(xì)胞混懸液制備：術(shù)中留取常規(guī)病理檢查所需腫瘤組織后，將剩余腫瘤組織按RECELL表皮細(xì)胞分離試劑盒標(biāo)準(zhǔn)操作流程進行消化處理[6]：將腫瘤組織放入專用反應(yīng)盒中，加入試劑盒專用消化酶消化60 min，人工剝離表皮，沖洗并收集表皮細(xì)胞混懸液。分離后取少量細(xì)胞做臺盼藍(lán)染色驗證細(xì)胞活性，分離15、30、45、60 min時存活率分別為83.3%、70%、50%、10%，即分離后可獲得高比例的活性表皮細(xì)胞，15～60 min內(nèi)細(xì)胞存活率隨著時間延長而降低。

5.涂片離心及免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定：每份標(biāo)本分別取0.5ml細(xì)胞混懸液在cytospin3型自動涂片離心機中以1 600 r/min（離心半徑10 cm）離心涂片2 min，使細(xì)胞貼附于陽離子防脫玻片上，免疫細(xì)胞化學(xué)兩步法[7]對細(xì)胞涂片分別進行S100、Melan?A和AE1/AE3免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定。丙酮固定、雙氧水和羊血清工作液處理后分別加入鼠源抗S100、Melan?A和AE1/AE3抗體，并以PBS作為對照，于4℃孵育12h，在復(fù)溫并洗脫之后加入山羊抗小鼠IgG抗體，于37℃孵育30 min，隨后滴加二氨基聯(lián)苯胺顯色液顯色并以蘇木精染色，最后經(jīng)過脫色脫水以及二甲苯立體化和樹脂封片后置于顯微鏡下觀察，每份標(biāo)本分析100個細(xì)胞，分別統(tǒng)計其中黑素來源細(xì)胞（S100和/或melan?A陽性）和角質(zhì)形成細(xì)胞（AE1/AE3陽性）的比例。

6.細(xì)胞形態(tài)分析：在細(xì)胞懸液狀態(tài)下，對A375細(xì)胞、PIG1細(xì)胞、HaCaT細(xì)胞、原位惡黑分離細(xì)胞、侵襲性惡黑分離細(xì)胞、交界痣分離細(xì)胞進行形態(tài)學(xué)觀察和測量。每種細(xì)胞系及每份來自患者的標(biāo)本分析100個細(xì)胞，統(tǒng)計細(xì)胞直徑、胞質(zhì)顆?；潭龋ǚ蔷|(zhì)化區(qū)域占胞質(zhì)面積的百分比）。

7.細(xì)胞純化：利用有限稀釋法[8]分別將來源于5例原位惡黑患者的表皮單細(xì)胞分離到96孔板中，依據(jù)胞質(zhì)顆?；潭雀叩蛷谋砥渭?xì)胞中純化黑素來源細(xì)胞，具體方法為：在光鏡下觀察每一孔板中單細(xì)胞的胞質(zhì)顆?；潭?，收集胞質(zhì)高顆?；募?xì)胞（非均質(zhì)化區(qū)域占胞質(zhì)面積＞50%），每份標(biāo)本共收集200個細(xì)胞。將純化所得細(xì)胞離心涂片和S100免疫細(xì)胞化學(xué)染色，每份標(biāo)本分析100個細(xì)胞，統(tǒng)計評估純化后黑素來源細(xì)胞（S100陽性）的比例，計算純化效率。

8.原位惡黑細(xì)胞的拉曼光譜測定：為進一步研究純化得到的原位惡黑細(xì)胞的拉曼光譜特征（反映腫瘤細(xì)胞膜表面的微觀結(jié)構(gòu)及介電特征），采用電化學(xué)自組裝生長的金納米顆粒作為表面增強拉曼活性襯底，通過金納米顆粒與細(xì)胞膜緊密結(jié)合，增強細(xì)胞膜表面生物分子的拉曼信號，從而實現(xiàn)單細(xì)胞水平的拉曼光譜檢測。分別將從1例原位惡黑和1例交界痣患者標(biāo)本分離得到的原位惡黑細(xì)胞和交界痣細(xì)胞懸液滴于金納米顆粒表面增強拉曼活性襯底，在光鏡下確定細(xì)胞位置，利用顯微共焦激光拉曼光譜儀掃描得到細(xì)胞膜表面的拉曼強度分布，以拉曼峰譜表征不同類型細(xì)胞的細(xì)胞膜表面生物分子特征。拉曼光譜儀檢測參數(shù)：激光波長633 nm，功率5 mW，50倍物鏡。

二、結(jié)果

1.黑素來源細(xì)胞分離效率：見表1。原位惡黑、侵襲性惡黑、交界痣標(biāo)本間S100陽性率、Melan?A陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），原位惡黑中S100陽性率低于侵襲性惡黑（t=7.2，P＜0.05），而與交界痣間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.1，P＞0.05）。原位惡黑Melan?A陽性率低于侵襲性惡黑（t=9.2，P＜0.05），高于交界痣（t=9.0，P＜0.05）。3種標(biāo)本來源細(xì)胞AE1/AE3陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 原位惡性黑素瘤、侵襲性惡性黑素瘤、交界痣分離所得細(xì)胞混懸液中S100、Melan?A、AE1/AE3陽性率（±s，%）

表1 原位惡性黑素瘤、侵襲性惡性黑素瘤、交界痣分離所得細(xì)胞混懸液中S100、Melan?A、AE1/AE3陽性率（±s，%）

細(xì)胞來源原位惡性黑素瘤侵襲性惡性黑素瘤交界痣F值P值例數(shù)9 5 5 S100 14.1±1.5 22.0±2.7 11.8±1.9 38.5＜0.05 Melan?A 10.2±1.7 17.4±1.1 3.2±0.8 127.8＜0.05 AE1/AE3 74.7±5.0 71.2±3.3 76.0±5.8 1.3＞0.05

2.黑素瘤細(xì)胞形態(tài)特征分析：原位惡黑、侵襲性惡黑、交界痣標(biāo)本中分離所得的細(xì)胞混懸液中，黑素來源細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞直徑之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而顆?；潭乳g差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。A375、PIG1、HaCaT細(xì)胞系細(xì)胞直徑差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；顆粒化程度差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），A375、PIG1細(xì)胞胞質(zhì)顆?；潭染哂贖aCaT細(xì)胞（t值分別為18.0、17.0，P＜0.05）。見表3。

表2 不同來源的黑素（瘤）細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞直徑、胞質(zhì)顆?；潭缺容^（±s）

表2 不同來源的黑素（瘤）細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞直徑、胞質(zhì)顆?；潭缺容^（±s）

細(xì)胞黑素（瘤）細(xì)胞角質(zhì)形成細(xì)胞t值P值原位惡性黑素瘤（9例）直徑（μm）15.5±2.0 15.2±3.1 0.6＞0.05顆粒化程度（%）67.1±11.4 46.2±11.5 8.6＜0.05侵襲性惡性黑素瘤（5例）直徑（μm）15.8±2.2 16.1±2.6 0.4＞0.05顆?；潭龋?）75.6±11.2 40.0±11.5 11.1＜0.05交界痣（5例）直徑（μm）14.5±2.2 15.2±2.8 1.0＞0.05顆?；潭龋?）65.2±11.9 40.8±12.6 7.0＜0.05

表3 三種細(xì)胞系直徑與胞質(zhì)顆?；潭缺容^（±s）

表3 三種細(xì)胞系直徑與胞質(zhì)顆?；潭缺容^（±s）

注：n=299。a與HaCaT胞質(zhì)顆粒化程度比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05

細(xì)胞系A(chǔ)375細(xì)胞PIG1細(xì)胞HaCaT細(xì)胞F值P值直徑（μm）15.2±1.6 15.0±1.8 14.7±1.3 0.6＞0.05顆?；潭龋?）46.8±8.0a 44.4±10.8a 4.4±5.1 205.2＜0.05

3.原位惡黑細(xì)胞純化效率：原位惡黑中的黑素瘤細(xì)胞比例純化前為（13.4±0.5）%，純化后提高到（22.2±1.0）%，純化前后差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=8.0，P＜0.05），平均純化效率為165.7%。

4.原位惡黑細(xì)胞拉曼光譜特征：電鏡下，襯底元件表面均勻分布金納米顆粒，細(xì)胞貼附在該襯底元件表面（圖1）。單細(xì)胞拉曼光譜檢測結(jié)果顯示，原位惡黑細(xì)胞和交界痣細(xì)胞的拉曼光譜峰值區(qū)域不重疊（圖2）。

三、討論

從原位惡黑標(biāo)本中分離并純化具有活性的黑素瘤細(xì)胞是研究原位惡黑的前提。有文獻報道，利用黑素細(xì)胞特異性培養(yǎng)技術(shù)可逐步純化黑素細(xì)胞[9]。由于腫瘤細(xì)胞基因組不穩(wěn)定，在經(jīng)過多次增殖、傳代后，腫瘤細(xì)胞可能產(chǎn)生與原發(fā)疾病不相關(guān)的基因突變或染色體變異，干擾后續(xù)實驗分析。既往還曾利用膠原酶、胰酶消化皮膚制備細(xì)胞懸液，然而制備過程中，處理時間、溫度、消化酶的濃度難以精確控制，實驗過程很容易對細(xì)胞造成損傷，或者降低分離效率[10]。近年RECELL試劑盒被批準(zhǔn)臨床應(yīng)用，該標(biāo)準(zhǔn)試劑盒提供了專用的反應(yīng)裝置和消化酶，可高效地獲得具有活性的表皮細(xì)胞混懸液，已應(yīng)用于移植表皮單細(xì)胞治療燒傷和白癜風(fēng)等[11?12]。

本文采用RECELL試劑盒分離得到的表皮單細(xì)胞懸液，主要包括角質(zhì)形成細(xì)胞和黑素細(xì)胞（在腫瘤標(biāo)本中還包含黑素瘤細(xì)胞）。利用免疫細(xì)胞化學(xué)染色區(qū)分這兩種細(xì)胞并結(jié)合相應(yīng)細(xì)胞系進行形態(tài)學(xué)分析，我們觀察到角質(zhì)形成細(xì)胞和黑素（瘤）細(xì)胞在單細(xì)胞懸液狀態(tài)下，存在一定的形態(tài)學(xué)差異，主要體現(xiàn)在黑素（瘤）細(xì)胞胞質(zhì)的顆粒化程度高于角質(zhì)形成細(xì)胞。經(jīng)過有限稀釋法分選出胞質(zhì)高顆?；潭鹊募?xì)胞后，黑素瘤細(xì)胞純度有顯著提高，提示利用黑素（瘤）細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞在胞質(zhì)顆?；潭确矫娴牟町愡M行形態(tài)區(qū)分具有可行性。

圖1 金納米顆粒表面增強拉曼活性襯底和細(xì)胞貼附其表面的電鏡圖片 1A：襯底元件表面均勻分布金納米顆粒（紅色箭頭）；1B：細(xì)胞貼附在該襯底元件表面（黃色箭頭）

圖2 原位惡性黑素瘤及交界痣細(xì)胞拉曼光譜 原位惡性黑素瘤細(xì)胞和交界痣細(xì)胞的拉曼光譜峰值區(qū)域不重疊。左上角細(xì)胞圖像為所測單細(xì)胞的顯微鏡下形態(tài)

受限于有限稀釋法對細(xì)胞分選的效率較低，最終純化得到的細(xì)胞總量僅為102個左右，而免疫熒光共染過程中存在多次洗脫抗體的操作，不可避免地?fù)p失大量細(xì)胞，實驗可行性較差。我們采用離心涂片聯(lián)合免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定不同來源的細(xì)胞，從而避免細(xì)胞損失。細(xì)胞免疫分子標(biāo)記選擇方面，我們在確定標(biāo)本分別為原位惡黑、侵襲性惡黑、交界痣的前提下，分別選取S100、Melan?A、AE1/AE3鑒定相應(yīng)標(biāo)本中的黑素來源細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞。不可否認(rèn)僅選用S100和Melan?A兩種黑素細(xì)胞相關(guān)免疫標(biāo)記進行檢測，會遺漏部分特殊免疫表型的黑素瘤細(xì)胞，導(dǎo)致對黑素來源細(xì)胞游離狀態(tài)的形態(tài)分析存在偏倚。這也可能是利用本純化方案僅可有限提高黑素（瘤）細(xì)胞比例，仍無法純化得到高純度黑素（瘤）細(xì)胞的原因。通過反復(fù)純化或借助流式細(xì)胞儀對細(xì)胞胞質(zhì)顆粒化差異的自動分選均有望進一步提高純化效率，以獲取高純度黑素（瘤）細(xì)胞用于后續(xù)細(xì)胞生物學(xué)實驗。

拉曼散射效應(yīng)是一種由分子振動和晶格振動導(dǎo)致的非彈性散射，可以表征特定的化學(xué)基團，其不同的峰譜對應(yīng)生物分子中不同的化學(xué)鍵，而峰值強度對應(yīng)于這個化學(xué)鍵的數(shù)量。由于不同生物樣品表面化學(xué)基團成分存在差異，可檢測到不同的拉曼光譜特征，從而可以實現(xiàn)對生物樣品的識別和檢測，目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于各種生物樣品研究。在腫瘤研究中，可用于區(qū)別腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞[13]。近期也有研究初步證明了其在鑒別惡黑和良性色素痣中的價值[14]，我們的實驗完成了對原位惡黑單細(xì)胞的拉曼光譜檢測，為利用這項技術(shù)鑒別良惡性黑素細(xì)胞奠定了基礎(chǔ)。

我們利用標(biāo)準(zhǔn)化的表皮消化技術(shù)，從原位惡黑標(biāo)本中分離得到了活性表皮細(xì)胞，結(jié)合細(xì)胞免疫化學(xué)染色、細(xì)胞形態(tài)分析和有限稀釋法，分選出胞質(zhì)高顆?；潭鹊募?xì)胞，從而提高了黑素瘤細(xì)胞的比例，并初步研究了其拉曼光譜特征。研究結(jié)果提示，胞質(zhì)顆?；潭瓤勺鳛橹匾姆诌x指標(biāo)，用于發(fā)展并完善黑素（瘤）細(xì)胞的純化技術(shù)，有望解決原位惡黑細(xì)胞獲取的技術(shù)瓶頸，為進一步研究原位惡黑的細(xì)胞遺傳學(xué)和生物學(xué)特征提供可能。