消炎利膽膠囊的HPLC指紋圖譜研究

張繼紅，毛坤軍，周興卓，金賢武，黃平

（1.上饒市食品藥品檢驗檢測中心，江西 上饒 334000；2.江西醫(yī)學高等?？茖W校藥學系，江西 上饒334000；3.青島大學附屬醫(yī)院，山東 青島 266000）

消炎利膽膠囊是由溪黃草、穿心蓮、苦木3味中藥組成的中藥復(fù)方制劑，屬國家中藥保護品種；具有清熱、利膽、祛濕的功效[1]；主要用于口苦、脅痛、急性膽囊炎、膽管炎等疾病的治療[2]。目前，消炎利膽膠囊的質(zhì)量控制方法為國家食品藥品監(jiān)督管理局標準WS3-135（Z-135）-2002Z-2011，標準中以穿心蓮、溪黃草、苦木3味組成藥為對照藥材進行薄層色譜鑒別，以穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯為主要指標進行含量測定[3]。文獻報道，消炎利膽膠囊質(zhì)量分析主要涉及穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯及綠原酸、迷迭香酸的含量測定[4-6]。此中藥復(fù)方制劑指紋圖譜的研究還未見報道，無法全面反映該藥的整體質(zhì)量。《中華人民共和國藥典》（2010年版）編制大綱中提出中成藥質(zhì)量標準應(yīng)“逐步由單一指標性成分定性定量測定，向活性、有效成分及生物測定的綜合檢測過渡，向多成分和指紋或特征圖譜整體質(zhì)量控制模式轉(zhuǎn)化”的指導思想[7]，故本實驗采用高效液相色譜法（HPLC）研究不同廠家生產(chǎn)的13批消炎利膽膠囊的指紋圖譜，建立了分離度、重現(xiàn)性均較好的HPLC，為建立消炎利膽膠囊全面、整體的質(zhì)量控制方法提供科學依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters2695高效液相色譜儀（美國Waters公司）：包括waters e2489檢測器，Empower3工作站；CPA225D型電子天平（德國賽多利斯）；KQ-500DE型超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）；純水儀（易普易達科技有限公司）；《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》軟件2012版（國家藥典委員會）。

1.2 試藥

對照品：綠原酸（批號：1100753-201415）、迷迭香酸（批號：111871-201502）、咖啡酸（批號：110885-200102）均購自中國食品藥品檢定研究院，純度均≥98%；穿心蓮對照藥材（121082-201502）、溪黃草對照藥材（121488-201102）、苦木對照藥材（121017-201305）購自中國食品藥品檢定研究院；消炎利膽膠囊（S1-S8為哈爾濱一洲制藥有限公司產(chǎn)品，批號分別為：131003，150202，141007，151112，140805，141004，150904，141205；S9-S13為貴州景誠制藥有限公司產(chǎn)品，批號分別為20170123，20161202，20151103，2016114，20170112）；色譜級甲醇購自Merck公司；磷酸、分析甲醇為北京化工產(chǎn)品；水為去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Gemini-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相A：乙腈，流動相B：0.1%磷酸水溶液；流速1.0 mL/min；柱溫30℃；檢測波長為330 nm；進樣量10 μL。采用如下梯度洗脫程序：0～20 min，6%～20%（A）；20～45 min，20%～26%（A）；45～60 min，26%～60%（A）。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備精密稱取綠原酸、咖啡酸、迷迭香酸對照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為62.1，78.3，49.8 μg/mL 的混合對照品溶液，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備消炎利膽膠囊10粒，將內(nèi)容物研細、混勻，稱量約1.0 g，置100 mL量瓶中，加入70%甲醇50 mL，精密稱定，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，冷卻，稱重，用70%甲醇補足失重，搖勻，即得。

2.2.3 消炎利膽膠囊組成藥提取物溶液的制備取穿心蓮、溪黃草、苦木對照藥材粉末各500 mg，分別置于100 mL的量瓶中，加入70%甲醇50 mL，精密稱定，超聲處理30 min，取出，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足減失的質(zhì)量，制成質(zhì)量濃度約為10 mg/mL的供試品溶液，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗取批號為150904的消炎利膽膠囊，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行檢測。連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖。以綠原酸為參照峰，其保留時間和峰面積為1，計算出23個共有色譜峰的相對保留時間的RSD值＜2.0%，相對峰面積的RSD值＜3.0%，表明儀器的精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗取批號150904的消炎利膽膠囊，平行6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行檢測，記錄色譜圖。以綠原酸為參照峰，其保留時間和峰面積為1，計算出23個共有色譜峰的相對保留時間的RSD值＜2.0%，相對峰面積的RSD值＜3.0%，表明本方法的重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗取批號150904的消炎利膽膠囊，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件分別在0，2，4，8、12，24 h檢測，記錄色譜圖。以綠原酸為參照峰，其保留時間和峰面積為1，計算出23個共有色譜峰的相對保留時間的RSD值＜2.0%，相對峰面積的RSD值＜3.0%，表明本方法的穩(wěn)定性良好。

2.4 HPLC指紋圖譜的生成及共有峰的歸屬和指認

2.4.1 HPLC指紋圖譜的生成取13批各樣品適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件檢測，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版）分析l3批樣品的HPLC圖譜。結(jié)果顯示共有特征峰23個，其中6號色譜峰的峰形好、分離度高、含量高，選擇作為參照峰。見圖1。

圖1 13批消炎利膽膠囊指紋圖譜

2.4.2 共有峰的指認和歸屬取混合對照品溶液、供試品溶液及各組成藥提取物的供試品溶液，采用HPLC分析，結(jié)果：樣品HPLC圖譜23個共有峰中1，2，3，4，5，7，8，9，10，16，17，20 號來源于苦木；4，6，7，9，10，12，13，14，18，19，20，21，23 來源于穿心蓮；5，8，9，11，12，14，15，16，17，20，22 來源于溪黃草；共有峰中6，8，22分別指認為綠原酸、咖啡酸和迷迭香酸。見圖2。

2.4.3 相似度與各共有峰相關(guān)數(shù)據(jù)分析采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版）對13批樣品的HPLC圖譜進行比較分析。結(jié)果，13批樣品的HPLC圖譜相似度均＞0.90。見表1。

表1 13批利膽消炎膠囊指紋圖譜相似度數(shù)據(jù)

圖2 混合對照品溶液、供試品溶液及各組成藥提取物的HPLC圖

2.4.4 聚類和統(tǒng)計分析將13批消炎利膽膠囊中的23個特征峰的峰面積數(shù)據(jù)進行聚類分析和統(tǒng)計分析。從聚類方面看，S1-S8和S9-S13分類明顯，其中S1-S8來自哈爾濱一洲制藥有限公司，S9-S13來自貴州景誠制藥有限公司，這可能與廠家的生產(chǎn)工藝和原料來源不同有關(guān)。另外，哈爾濱一洲制藥有限公司的消炎利膽膠囊（S1-S8）離散程度比較大，貴州景誠制藥有限公司的消炎利膽膠囊（S9-S13）離散程度比較小，可見貴州景誠制藥有限公司生產(chǎn)的藥品穩(wěn)定性更好。見圖3。

圖3 13批消炎利膽膠囊23個特征峰OPLS-DA圖和OPLS-DA3D圖

3 討論

3.1 流動相的選擇

研究表明，穿心蓮、溪黃草中主要含有酸性成分[8-9]，苦木中主要含有生物堿類成分[10]。為盡可能多地反映出各藥物所含成分的信息，實驗比較分析了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-磷酸水（分別為體積分數(shù)0.1%甲酸和0.1%磷酸），乙腈-堿水（體積分數(shù)為0.02%氨水）不同梯度下的色譜圖，最終發(fā)現(xiàn)以乙腈-0.1%磷酸水作為流動相時，所得圖譜基線平、分離度好、峰型好。

3.2 提取條件的選擇

試驗考察提取溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇效果優(yōu)于乙醇，因此選擇甲醇作為提取溶劑；分別考察不同濃度（50%，70%，100%）和不同用量（25，50，100倍）的甲醇來提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)50倍量溶劑70%甲醇提取效率最高；考察提取方法（超聲和回流）、提取時間(15，30，45，60 min)的選擇，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲處理30 min效率最高，故本試驗最終以50倍量的70%甲醇超聲提取30 min作為供試品制備方法。

3.3 參照峰的選擇

通過標準品比對指認出6號峰為綠原酸，藥理活性研究表明，綠原酸具有明顯的抗氧化、抗菌、抗病毒以及免疫調(diào)節(jié)等作用[11-12]，常作為中藥及其制劑含量測定的指標性成分[13]，本試驗圖譜中綠原酸保留時間穩(wěn)定，峰面積大小適中，且與前后色譜峰分離度較好，故選為參照峰。

本試驗通過《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版）對13批樣品的HPLC圖譜進行分析，得出指紋圖譜與對照圖譜的相似度均＞0.90，表明采用指紋圖譜對消炎利膽膠囊進行質(zhì)量控制，操作簡單、穩(wěn)定可靠、專屬性強、重復(fù)性好，并能輔助含量測定，為消炎利膽膠囊的鑒別和質(zhì)量評價提供全方位的參考。