神經(jīng)生長因子受體p75NTR在喉癌Hep2細(xì)胞系中的表達(dá)

申宇鵬 李曉明 靳海峰 路秀英

摘 要：目的 初步探索神經(jīng)生長因子受體在喉癌Hep2細(xì)胞系的表達(dá)情況并研究相關(guān)的細(xì)胞生物學(xué)特性。方法 應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)及免疫熒光染色法，檢測p75NTR在喉癌Hep2細(xì)胞系中的表達(dá)；應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測人喉癌Hep2細(xì)胞系中呈p75NTR高表達(dá)及CD133高表達(dá)細(xì)胞的分布比例情況。結(jié)果 喉癌Hep2細(xì)胞系內(nèi)小部分腫瘤細(xì)胞顯示免疫染色強(qiáng)陽性，p75NTR強(qiáng)陽性顯色的細(xì)胞部分處于旺盛的增殖分裂狀態(tài)；大部分呈CD133強(qiáng)陽性的Hep2細(xì)胞也呈p75NTR強(qiáng)陽性。結(jié)論 p75NTR高表達(dá)于喉癌Hep2細(xì)胞系中具有較強(qiáng)增殖活力的細(xì)胞，p75NTR信號(hào)通路對支持或促進(jìn)喉癌細(xì)胞增殖具有潛在作用。p75NTR高表達(dá)的喉癌Hep2細(xì)胞與腫瘤干細(xì)胞之間的關(guān)系密切，有待進(jìn)一步深入研究。

關(guān)鍵詞：神經(jīng)生長因子受體；喉癌；Hep2細(xì)胞系；免疫細(xì)胞化學(xué)

中圖分類號(hào)：R739.65 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.15.016

文章編號(hào)：1006-1959（2018）15-0047-05

Expression of Nerve Growth Factor Receptor p75NTR in Hep2 Cell Line of Laryngeal Squamous Cell Carcinoma

SHEN Yu-peng1，LI Xiao-ming1，JIN Hai-feng2，LU Xiu-ying1

（Department of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery1，Department of Digestive Medicine2，Bethune International Peace Hospital，Shijiazhuang 050081，Hebei，China）

Abstract：Objective To investigate the expression of nerve growth factor receptor in laryngeal squamous cell carcinoma Hep2 cell line and to study the related cellular biological characteristics.Methods Immunocytochemistry and immunofluorescence staining were used to detect the expression of p75NTR in Hep2 cell line of laryngeal squamous cell carcinoma，and the distribution of p75NTR and CD133 in Hep2 cell line of laryngeal squamous cell carcinoma was detected by flow cytometry.Results A small number of tumor cells in the Hep2 cell line of laryngeal squamous cell carcinoma showed strong immunostaining，and the cells with strong positive coloration of p75NTR were in a proliferative and dividing state；most of the Hep2 cells positive for CD133 were also strongly positive for p75NTR.Conclusion p75NTR is highly expressed in the Hep2 cell line of laryngeal squamous cell carcinoma and has strong proliferative activity.The p75NTR signaling pathway has a potential role in supporting or promoting the proliferation of laryngeal squamous cell carcinoma cells.The relationship between p75NTR-expressing laryngeal squamous cell carcinoma Hep2 cells and tumor stem cells is closely related and needs further study.

Key words：Nerve growth factor receptor；Laryngeal squamous cell carcinoma；Cell line Hep2；Immunocytochemistry

喉癌（laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC）是頭頸外科臨床常見惡性腫瘤，喉癌通常可以損害患者的發(fā)音、呼吸、吞咽等功能，同時(shí)又具有破壞力強(qiáng)、易復(fù)發(fā)、易轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，臨床上很多患者難以治愈甚至危及生命。研究喉癌發(fā)病及惡性進(jìn)展的相關(guān)機(jī)制，有助于探索治愈喉癌的有效途徑。近年來腫瘤干細(xì)胞理論逐漸成熟，眾多學(xué)者認(rèn)為腫瘤組織內(nèi)部包含少量擁有自我更新能力、分化能力及放化療抵抗能力的特殊細(xì)胞群，與腫瘤的治療后復(fù)發(fā)密切相關(guān)[1]。神經(jīng)生長因子受體p75NTR（p75 neurotrophin receptor，p75NTR）是腫瘤壞死因子受體（tumor necrosis factor receptor，TNFR）超家族成員之一，廣泛分布于人體各組織系統(tǒng)及腫瘤細(xì)胞中[2]。除中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)外，p75NTR蛋白也廣泛地表達(dá)于上皮、間葉及淋巴造血組織等非神經(jīng)組織系統(tǒng)。研究證實(shí)p75NTR在不同組織細(xì)胞類型、不同病理生理環(huán)境中執(zhí)行的功能具有多樣性，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的存活、增殖、分化、凋亡及創(chuàng)傷修復(fù)等效應(yīng)[3]。近年來p75NTR在腫瘤細(xì)胞中的存在及作用引起廣泛關(guān)注，目前國內(nèi)外關(guān)于p75NTR在喉癌細(xì)胞系中的表達(dá)及功能文獻(xiàn)少有報(bào)道，我們采用免疫細(xì)胞化學(xué)及流式細(xì)胞儀等方法研究p75NTR在喉癌Hep2細(xì)胞系中的表達(dá)規(guī)律和潛在作用，為進(jìn)一步研究喉癌的綜合治療提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1 Hep2細(xì)胞 人喉癌Hep2細(xì)胞系來自美國國家癌癥研究所病理實(shí)驗(yàn)室，由白求恩國際和平醫(yī)院耳鼻咽喉科實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)。凍存Hep2細(xì)胞于37 ℃快速解凍，1000 rpm離心 5 min，用RPMI 1640培養(yǎng)基清洗1次，重懸后再離心，使用全培養(yǎng)基，設(shè)置為37 ℃培養(yǎng)于5%CO2的濕度培養(yǎng)箱中。

1.2主要抗體及試劑盒 免疫細(xì)胞化學(xué)試劑盒（SP-9002）系北京中杉金橋生物技術(shù)公司產(chǎn)品；磁珠分選試劑盒購自德國美天旎公司，p75NTR兔抗人單克隆抗體（ab52987）購自Abcam公司；CD133（18470-1-AP，proteintech）；HRP-山羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)公司）；CY3標(biāo)記兔二抗（protech）；Hoechst（碧云天）。

1.3儀器設(shè)備 熒光顯微鏡（DMIRB，德國Leica）；TGL-16G高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；流式細(xì)胞儀（美國Becton Dickinson FAC公司）；Hera CO2培養(yǎng)箱（德國GMBH公司）。

1.4免疫細(xì)胞化學(xué)及免疫熒光染色 將清潔消毒的20 mm蓋玻片置于六孔板培養(yǎng)皿中，以5×104/ml的密度在六孔板中接種細(xì)胞并爬片，48 h后行免疫細(xì)胞化學(xué)及免疫熒光染色。貼壁均勻的Hep2細(xì)胞爬片經(jīng)4%多聚甲醛PB固定10 min，0.2%Triton X-100（含0.1%BSA）孵育10 min。免疫化學(xué)染色采用常規(guī)SP法。鋪片經(jīng)3%過氧化氫溶液去除內(nèi)源性過氧化物酶活性；滴加封閉用山羊血清，室溫孵育20min，消除非特異性顯色后，滴加一抗（p75NTR單克隆抗體稀釋度1∶50），4 ℃孵育過夜；陰性對照組采用PBS抗體稀釋液代替一抗；生物素標(biāo)記二抗及辣根酶標(biāo)記鏈霉素卵白素分別孵育20 min；使用新鮮配制的DAB顯色2 min，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水、透明及中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

將前面制備的96孔板中的陽性細(xì)胞和陰性細(xì)胞分別進(jìn)行p75NTR和CD133免疫熒光檢測。細(xì)胞經(jīng)4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次；采用5%胎牛血清室溫下封閉1 h；添加一抗（P75NTR：1∶400；CD133：1∶100）4 ℃孵育過夜；PBS洗清洗后加二抗，37 ℃孵育1 h；室溫避光孵育Hoechst 15 min，熒光顯微鏡下拍照。

1.5喉癌Hep2細(xì)胞行p75NTR/CD133流式細(xì)胞儀檢測

1.5.1常規(guī)培養(yǎng)條件下Hep2細(xì)胞p75NTR陽性率檢測 喉癌Hep2細(xì)胞系培養(yǎng)在含有5%小牛血清，100 U/ml青霉素，100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，傳代次數(shù)<30次。制備活性高的細(xì)胞懸液，用含5%FCS的RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/ml，取200 μl細(xì)胞懸液（數(shù)量約2×106細(xì)胞）加入含2%BSA的PBS，4 ℃封閉30 min，用洗滌液洗滌1次，加洗滌液2 ml左右1000 rpm×5 min棄上清?？贵w終濃度標(biāo)準(zhǔn)為：p75NTR（FITC）1 μg/L×106細(xì)胞（1∶10），陰性對照采用小鼠IgG1同型對照（FITC）1∶10?；旌铣浞趾? ℃ 30 min；用洗滌液洗滌2次，立即上流式細(xì)胞儀檢測。

1.5.2常規(guī)培養(yǎng)的Hep2細(xì)胞行p75NTR/CD133雙標(biāo)記檢測 檢測步驟與前類似，同時(shí)加入p75NTR（FITC 1∶10）及CD133（PE 1∶11）兩種熒光直標(biāo)抗體，共同避光孵育4 ℃ 30 min，洗滌2次后上流式細(xì)胞儀檢測，參考同型對照來調(diào)節(jié)電壓補(bǔ)償。檢測p75NTR/CD133雙陽性細(xì)胞占總體細(xì)胞數(shù)的百分比。

2結(jié)果

2.1 p75NTR在喉癌Hep2細(xì)胞系中的表達(dá)情況 我們采用p75NTR單克隆抗體對喉癌Hep2細(xì)胞系行免疫細(xì)胞化學(xué)染色及免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)相同結(jié)果：一小部分Hep2細(xì)胞呈p75NTR免疫反應(yīng)強(qiáng)陽性（計(jì)數(shù)約4%～6%），見圖1，免疫著色主要位于胞漿及胞膜。鏡下可見部分p75NTR強(qiáng)陽性細(xì)胞正處于細(xì)胞分裂狀態(tài)，也觀察到正處在DNA合成期、細(xì)胞分裂期及分裂后期的細(xì)胞也呈p75NTR強(qiáng)陽性染色。鏡下計(jì)數(shù)約30%～40%的細(xì)胞呈p75NTR免疫反應(yīng)弱陽性，該部分細(xì)胞很少處于分裂期。此外，我們觀察到也有一些鏡下形態(tài)規(guī)則、外觀為圓形及梭型的細(xì)胞呈p75NTR強(qiáng)陽性，這些細(xì)胞生長狀態(tài)良好，并非凋亡的無結(jié)構(gòu)殘?bào)w，我們推測這部分細(xì)胞可能與腫瘤干細(xì)胞群比較接近。將Hep2細(xì)胞行p75NTR免疫熒光染色（CY3），采用Hoechst做核標(biāo)記，也觀察到上述類似結(jié)果。通過免疫細(xì)胞化學(xué)及免疫熒光染色我們確定p75NTR蛋白表達(dá)和喉癌Hep2細(xì)胞分裂增殖密切相關(guān)。

2.2喉癌Hep2細(xì)胞行p75NTR/CD133流式細(xì)胞儀檢測 為進(jìn)一步分析喉癌Hep2細(xì)胞系中p75NTR強(qiáng)陽性表達(dá)細(xì)胞的特點(diǎn)，我們進(jìn)行了流式細(xì)胞儀檢測。發(fā)現(xiàn)正常培養(yǎng)條件下，使用鼠IgG1同型對照FITC抗體，人喉癌Hep2細(xì)胞系中呈p75NTR強(qiáng)陽性的細(xì)胞比例為3.7%～6.2%左右。使用CD133抗體與p75NTR做雙標(biāo)記檢測，雙向十字門流式散點(diǎn)圖可見，CD133強(qiáng)陽性細(xì)胞比率約0.7%，p75NTR及CD133雙標(biāo)陽性細(xì)胞比率僅為0.5%。其中大部分CD133強(qiáng)陽性細(xì)胞也呈p75NTR強(qiáng)陽性。見圖2，圖3。

3討論

近年來針對頭頸部鱗狀細(xì)胞癌臨床治療中的易轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)、放化療耐受等特性和內(nèi)在作用機(jī)制成為頭頸腫瘤科學(xué)研究的熱點(diǎn)。腫瘤組織在機(jī)體內(nèi)的發(fā)病及生長都處在體液內(nèi)環(huán)境中，受到人體微環(huán)境中眾多生長因子及相關(guān)受體通路的調(diào)節(jié)及支持。神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族重要成員，在神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的發(fā)育和再生過程中有重要作用[4]，NGF擁有低親和力的p75受體（p75NTR）和高親和力酪氨酸激酶受體（Trks），NGF與受體p75NTR和TrkA之間相互作用非常緊密，調(diào)控機(jī)理很復(fù)雜。p75NTR屬于細(xì)胞Ⅰ型跨膜糖蛋白，含有三個(gè)結(jié)構(gòu)域：富含半胱氨酸的膜外區(qū)、一次性跨膜區(qū)、連接下游信號(hào)途徑的胞內(nèi)區(qū)，共399個(gè)氨基酸組成。胚胎發(fā)育的早期，三個(gè)胚層的細(xì)胞均有p75NTR表達(dá)，發(fā)育成熟后部分組織內(nèi)的表達(dá)下降或消失，在神經(jīng)系統(tǒng)、上皮系統(tǒng)組織細(xì)胞內(nèi)，發(fā)育成熟后仍有p75NTR表達(dá)?，F(xiàn)有文獻(xiàn)支持，NGF及其受體在上皮來源惡性腫瘤的生長過程中有重要作用[5]。以往關(guān)于p75NTR的研究大多針對神經(jīng)系統(tǒng)，在腫瘤細(xì)胞中的報(bào)道很少。我們前期通過免疫組織化學(xué)形態(tài)學(xué)研究已經(jīng)證實(shí)，p75NTR在喉癌組織內(nèi)存在陽性染色，目前p75NTR在喉癌細(xì)胞系中表達(dá)情況尚缺乏研究證實(shí)。

近年來有關(guān)p75NTR受體在腫瘤生長、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移中的作用引起國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注。越來越多的研究表明p75NTR在腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、治療耐藥中發(fā)揮了重要的作用，現(xiàn)有文獻(xiàn)證實(shí)，不同組織類型腫瘤中p75NTR執(zhí)行的功能具有多樣性。Jin HF在胃癌的研究中證實(shí)p75NTR表達(dá)明顯降低或缺失，其表達(dá)水平與胃癌的分化程度負(fù)相關(guān)，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染p75NTR表達(dá)質(zhì)?？梢悦黠@抑制胃癌細(xì)胞的增殖[5]。在膀胱癌及前列腺癌中p75NTR存在類似的抑癌作用[6]，學(xué)者們推測p75NTR抑制腫瘤的調(diào)節(jié)機(jī)制可能與其誘導(dǎo)凋亡的信號(hào)通路激活有關(guān)。與之相反，p75NTR在上皮細(xì)胞、食道、舌、口腔黏膜上皮等細(xì)胞中擁有明確的促增殖效應(yīng)，這種效應(yīng)也存在于這些組織起源的腫瘤細(xì)胞中。文獻(xiàn)報(bào)道神經(jīng)營養(yǎng)因子通過其受體p75NTR及Trk刺激黑色素瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)染p75NTRsiRNA能抑制黑色素瘤細(xì)胞遷移[7]。有文獻(xiàn)報(bào)道，食道鱗癌細(xì)胞系中p75NTR表達(dá)對細(xì)胞的存活和增殖具有支持作用，另有研究證實(shí)p75NTR結(jié)合其功能性配體NGF后，能通過激活NF-κB通路抑制乳腺癌細(xì)胞凋亡[8]。Soland經(jīng)過口腔鱗癌的形態(tài)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，p75NTR表達(dá)和分布區(qū)域特性的改變能夠判斷患者治療后復(fù)發(fā)或預(yù)后不良[9]。至今p75NTR在頭頸腫瘤細(xì)胞中的調(diào)控機(jī)制尚未明確，與頭頸腫瘤組織細(xì)胞類型、分化程度、局部微環(huán)境等相關(guān)。

我們前期形態(tài)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在喉鱗癌組織中TrkA及p75NTR的陽性染色呈現(xiàn)特征性分布[10]，p75NTR表達(dá)多位于粘膜基底層及腫瘤生發(fā)層，位于增殖活力旺盛的區(qū)域。通過免疫細(xì)胞化學(xué)及免疫熒光染色的方法，我們證實(shí)：人喉癌Hep-2細(xì)胞系中小部分Hep2細(xì)胞呈p75NTR強(qiáng)陽性。我們也觀察到，許多處在DNA合成期、細(xì)胞分裂期及分裂后期的Hep2細(xì)胞呈p75NTR免疫染色強(qiáng)陽性，這提示我們p75NTR表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖分裂密切相關(guān)。干細(xì)胞學(xué)說認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞（CSC）是腫瘤組織中具有自我更新、分化及增殖能力的特殊細(xì)胞。干細(xì)胞可以產(chǎn)生快速增生祖細(xì)胞群，針對干細(xì)胞及耐藥細(xì)胞的相關(guān)研究是目前腫瘤基礎(chǔ)研究熱點(diǎn)。尋找特異性的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物，對腫瘤干細(xì)胞進(jìn)行靶基因干擾或分子靶向治療是眾多學(xué)者探索的方向。我們發(fā)現(xiàn)p75NTR高表達(dá)于Hep2細(xì)胞中的未成熟細(xì)胞和具有強(qiáng)分裂增殖能力的細(xì)胞，故喉鱗癌中的p75NTR陽性細(xì)胞可能包含有快速增生祖細(xì)胞群或干細(xì)胞群，p75NTR在終末分化的細(xì)胞中呈低表達(dá)，這與喉癌組織的相應(yīng)染色結(jié)果相符合，同時(shí)也與國外舌鱗癌細(xì)胞系的研究結(jié)果相近[11]。我們研究發(fā)現(xiàn)，p75NTR對喉癌細(xì)胞生長和增殖具有促進(jìn)支持的作用，p75NTR這種作用的發(fā)揮可能與喉癌中同時(shí)表達(dá)NGF及TrkA有關(guān)。Okumura等在食道鱗癌中有類似的研究結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染p75NTR siRNA后引起食道鱗癌細(xì)胞系的增殖抑制和凋亡上升，認(rèn)為p75NTR對食道鱗癌細(xì)胞的生長有支持作用，深入研究發(fā)現(xiàn)p75NTR陽性細(xì)胞與靜止期食道鱗癌干細(xì)胞比較接近[12]。

通過流式細(xì)胞儀檢測，我們發(fā)現(xiàn)喉癌Hep2細(xì)胞系中呈p75NTR強(qiáng)陽性的細(xì)胞比例僅為3.7%～6.2%左右。目前認(rèn)為腫瘤CSC僅占腫瘤細(xì)胞的很小部分，卻是腫瘤起源、放化療后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的根源[13]。研究腫瘤干細(xì)胞的特性，需要特異性的表面標(biāo)記將其從其它細(xì)胞中分離出來。目前國內(nèi)外相對公認(rèn)CD133是頭頸部鱗癌腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)記物[14]，因此我們使用CD133抗體與p75NTR做流式雙標(biāo)記檢測。雙向流式散點(diǎn)圖可見，p75NTR及CD133雙標(biāo)陽性細(xì)胞比率僅為0.5%。其中大部分CD133強(qiáng)陽性細(xì)胞也呈p75NTR強(qiáng)陽性。因此，我們推測p75NTR強(qiáng)陽性Hep2細(xì)胞中包含有腫瘤干細(xì)胞及快速增生祖細(xì)胞群。免疫染色結(jié)果提示p75NTR蛋白表達(dá)的上調(diào)和細(xì)胞分裂增殖密切相關(guān)，是伴隨細(xì)胞增殖而上調(diào)p75NTR表達(dá)水平，還是p75NTR陽性細(xì)胞自身擁有強(qiáng)增殖活性，有待我們深入研究證實(shí)。p75NTR既能通過胞內(nèi)死亡結(jié)構(gòu)域等途徑激活凋亡通路，也能通過激活NFκB促進(jìn)生存，充分說明其對細(xì)胞生存、分裂及凋亡的精確調(diào)控[15]。目前在喉癌組織細(xì)胞中，p75NTR依賴的促生存機(jī)制尚未闡明，我們推測p75NTR與喉癌細(xì)胞的增殖、分化、耐藥密切相關(guān)，探索如何通過p75NTR識(shí)別并殺傷喉癌腫瘤干細(xì)胞及耐藥細(xì)胞，為喉癌的綜合治療提供新的方向。

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收稿日期：2018-7-19；修回日期：2018-7-29

編輯/楊倩