細菌衍生物載體在腫瘤治療中的研究進展

朱辰奇，錢 晨，徐 柳，陳 瑞,胡榮峰，陳志鵬

(1.南京中醫(yī)藥大學藥學院,江蘇南京210023；2.蘇州市立醫(yī)院本部藥劑科,江蘇蘇州215002；3.安徽中醫(yī)藥大學藥學院，安徽合肥230038)

近年來，惡性腫瘤的治療仍然是困擾人類的一個重大難題?；熓悄[瘤治療中最主要的手段，但傳統(tǒng)化療藥物的靶向性和特異性較差，對正常組織和細胞會造成嚴重的不良反應。因此，非常有必要開發(fā)高特異性的藥物遞送系統(tǒng)，這對研究者來說也是一個巨大的挑戰(zhàn)[1]。

納米載藥系統(tǒng)因其獨特的高滲透、長滯留效應(EPR)在腫瘤治療中[2-4]具有很好的前景。因此，眾多優(yōu)良的納米載體被不斷地開發(fā)出來，比如介孔二氧化硅[5]、氧化石墨烯[6]、碳納米管[7]、金納米載體[8]和磁性納米載體[9]等。

納米有機載體因其低毒性、高生物相容性和可降解性的優(yōu)點，受到了研究人員的青睞。聚乙二醇(PEG)[10]、聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)[11]、人血清白蛋白[12]和脂質(zhì)體[13]等有機材料作為納米載體已經(jīng)獲得批準，并在臨床上得到廣泛的運用。這些載體通過結合多肽、配體等靶向基團的修飾，可進一步提高其特異性，聚集于腫瘤部位[14-15]，但是這些帶有靶向基團的納米載體制備難度和成本較高[16]，且由于人體自身存在的血液、腫瘤組織和腫瘤細胞等屏障[17]，達到腫瘤部位的載體數(shù)量十分有限[18-19]。

生物載體，如細菌載體，能夠克服多重生理屏障，并且可以通過基因工程獲得特定的靶向功能，這引起了研究人員的興趣[20]。細菌或者細菌衍生物首次作為載體用于遞送系統(tǒng)的研究可以追溯到20世紀90年代中期，Wells等[21]將食物中的乳酸菌用作黏膜疫苗的載體。不同種類的細菌，如梭狀芽胞桿菌(Clostridiumnovyi)[22]、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)[23]、大腸桿菌(Escherichiacoli)[24]、李斯特菌(Listeriamonocytogenes)[25]和乳酸菌(lactic-acid bacteria)[26]，作為載體被應用于癌癥、糖尿病和結腸炎等疾病的治療研究，得到了很多臨床試驗的證明[27]。但是，活菌作為一個外來體，直接作為載體時容易引起人的免疫反應，內(nèi)毒素的存在也可能引起宿主細胞的毒性反應。而細菌衍生物相對于活菌來說具有低免疫原性、低毒性的特點，并且其制備工藝簡單，可大規(guī)模生產(chǎn)，因此，其作為載體應用于遞釋系統(tǒng)具有很好的前景。以下就常見的細菌衍生物——細胞外膜囊泡、微細胞和細胞原生質(zhì)體囊泡作為遞釋系統(tǒng)的研究進展進行綜述。

1 細菌外膜囊泡(outer membrane vesicles,OMVs)

1.1 OMVs的來源及組成

細菌會在生長過程中的各個階段自然地將細胞膜上的納米脂蛋白分泌到膜外[28]，這種分泌囊泡的現(xiàn)象雖然被發(fā)現(xiàn)了40多年[29]，但是近幾年研究人員才發(fā)現(xiàn)這是細菌生長過程中的普遍現(xiàn)象，尤其是細菌受到外界刺激時[30]，更易分泌各種囊泡。這些囊泡的直徑在20～250 nm，通常是球形[31]，主要是由革蘭氏陰性菌中細菌的外膜(outer membrane,OM)釋放出來,因此被命名為OMVs[32]。近年，在少數(shù)革蘭氏陽性菌中也有OMVs存在的報道[33]。

由于細菌超強的變異性，當前對OMVs的產(chǎn)生機制還不明確。主要有3種假說:①Wensink等[34]提出，在OMVs的生物合成過程中，OM相對于肽聚糖底層生長更快，導致兩層之間的共價鍵被破壞，并開始形成囊泡；②Mcbroom等[35]提出，由于細胞周質(zhì)錯誤折疊的蛋白質(zhì)和肽聚糖片段不斷地累積，對OM施加了一種向外的壓力，OM最終膨脹至破裂并釋放出囊泡；③Schertzer等[36]提出，OMVs的形成是由于細胞外小葉不均勻延伸。雖然OMVs產(chǎn)生和調(diào)控背后的機制途徑和功能原因暫時還不明確，但是它們在細胞間信息交流、基因轉移及毒力因子、抗原和毒素的轉運等作用已經(jīng)得到了證實[37-42]。

大多數(shù)革蘭氏陰性細菌OM的主要組成部分是脂多糖，因此，它們的OMVs是免疫細胞的一種非常有效的激活劑。OMVs可以引導正常的宿主細胞發(fā)生適應性免疫應答，可以應用于疫苗和佐劑的開發(fā)。另一方面，在藥物遞送的過程中，理想的載體應該是非免疫原性或者非炎性的，避免引起患者炎癥反應。常見的可以有效降低細菌OMVs免疫原性的策略包括：①選擇非致病性細菌；②通過基因工程，移除、添加或修改產(chǎn)生OMVs菌株的膜蛋白和表面抗原[43]。

1.2 OMVs在藥物遞釋系統(tǒng)中的應用

在某些情況下，自然產(chǎn)生的OMVs可以直接作為遞藥載體，例如：用細菌的OMVs裝載免疫調(diào)節(jié)分子或者抗菌肽，OMVs通過黏附或者融合的方式將裝載的藥物遞送到靶細菌。通過融合蛋白，可以溶解或者殺死靶細菌，Kadurugamuwa等[44]發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌囊泡包含自溶素——胞壁質(zhì)水解酶，其能夠裂解其他革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌。利用這一特性可以將OMVs制成抗生素載體來殺死致病菌。

OMVs來自于不同的細菌種類，所以會展現(xiàn)出一系列不同的生物學效應。利用生物工程技術，分離出來的OMVs表面可以結合特定的配體，如抗體、細胞靶向肽、寡核苷酸適配體或抗原等，通過分子適應或體外生物綴合技術形成靶向納米載藥系統(tǒng)。利用基因工程技術，編碼OMVs細菌的細胞外膜表面或者其他膜結合蛋白的特定序列，從而產(chǎn)生可以靶向宿主細胞或組織的OMVs。Gujrati等[45]利用ClyA的尋址特性在大腸桿菌OMVs上表達對原癌基因人類表皮因子受體2(HER2)高親和力的HER2配體(AffiHER2OMVs)，如圖1所示。HER2是一種具有絡氨酸激酶活性的跨膜受體，其會在乳腺癌、卵巢癌及胃癌等腫瘤細胞中過度表達[46-47]。利用其對HER2的靶向，Gujrati[45]將裝載siRNA的OMVs遞送到腫瘤細胞，成功地使目標基因沉默，抑制腫瘤細胞生長。

圖1 表達HER2特異性親和體的OMV的示意圖[45]Fig.1 Schematic representation of OMVs expressing HER2-specific affibody (AffiHER2OMV)[45]

1.3 OMVs裝載DNA的機制

核酸運用于腫瘤的治療[48]是當前研究熱點，OMVs可以用來傳遞DNA[49]，但是關于DNA的裝載機制還存在很多爭議。Renelli等[50]在2004年提出的模型中，細菌裂解后釋放的細胞外DNA通過類似于細菌轉化中使用的機制被內(nèi)化在囊泡中，通過檢測出OMVs中的“裸”質(zhì)粒DNA來證實這個模型。他們還提出外源DNA可能通過打開和關閉一小部分OMVs來內(nèi)化，但是檢測到的DNA數(shù)量并不能完全證實這個猜想。

2010年Mashburn-Warren等[51]提出，在細菌OMVs釋放前，DNA是以某種方式從細胞質(zhì)透過質(zhì)膜再直接被OMVs包封，然而支持這個模型的實驗數(shù)據(jù)還不夠充分。

另一個是Pérez-Cruz等[52]在2013年通過高壓冷凍和冷凍置換(HPF-FS)的透射電子顯微鏡(TEM)技術，觀察到了北極泡狀希瓦氏菌M7T會產(chǎn)生雙層的OMVs，通過蛋白組學研究證實了該菌株的OMVs中存在質(zhì)膜和細胞質(zhì)蛋白質(zhì)，并使用免疫金滲濾法證實了囊泡內(nèi)DNA的存在。他們的研究也證實了Kadurugamuwa等[53]在1995年提出的觀點，肽聚糖層可以被自溶素降解，這種短暫和局部的破壞會導致細菌形成OMVs，OMVs中包含了DNA等物質(zhì)。

2 細菌原生質(zhì)體囊泡(bacterial protoplast-derived nanovesicles，PDNVs)

2.1 PDNVs的來源及組成

PDNVs是指細菌去除細胞壁剩下的部分[54]，制備PDNVs的方法較多，例如，酶降解[55]或用基因工程阻止細胞壁的合成[56]等。雖然PDNVs的毒性較小，目前還沒有體內(nèi)實驗證實其是否對人體存在安全性問題[55-56]，但是，它可以作為一個多功能的載體，容納不同特性的分子，如蛋白質(zhì)、化學物質(zhì)、核酸和脂質(zhì)。

2.2 PDNVs在藥物遞釋系統(tǒng)中的應用

Kim等[54]利用大腸桿菌制成了無毒的PDNVs(圖2)，以此作為疫苗的載體，比目前的疫苗載體引起更強的抗原特異性體液免疫應答和細胞免疫應答，更重要的是，PDNVs可以避免因細菌抗原引起的小鼠敗血癥，利用這些特性，PDNVs能在腫瘤免疫療法中有很大的潛力。

腫瘤細胞已經(jīng)被證實會過度表達表皮生長因子受體(EGFR)[58-59]，表皮生長因子(EGF)可以作為PDNVs的靶向部分，以靶向腫瘤細胞表面的表面生長因子受體。2017年， Kim等[60]設計并制造了表達EGFR的大腸桿菌原生質(zhì)體納米囊泡(EGFR-PDNV)，在體內(nèi)和體外實驗中以此來載藥的EGFR-PDNV都能有效地將藥物遞送至小鼠體內(nèi)腫瘤細胞，抑制腫瘤細胞生長，并且沒有發(fā)生有害反應。同時，他們提出了新的研究方向：①使用GE11肽或者HER2結合親和體分子作為靶向部分；②用聚乙二醇覆蓋PDNVs，延長血液循環(huán)時間。

圖2 PDNVs和載入抗原的PDNVs制備的示意圖[57]Fig.2 Schematicdiagram of PDNVs and antigen-loaded PDNVs preparation[57]

3 微細胞(minicells)

3.1 微細胞的來源和組成

MacDiarmid等[61]發(fā)現(xiàn)鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、弗氏志賀氏菌(Shigellaflexneri)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和單核細胞增多性李斯特氏菌可以通過minCDE蛋白產(chǎn)生染色體缺失的突變體——微細胞， minCDE蛋白通過抑制FtsZ來控制正常細菌的細胞分裂[62](圖3)。雖然這些微細胞直徑一般為(400±20) nm[58]，但是De Jong等[63]發(fā)現(xiàn)一個微細胞中可以裝載多達一百萬個藥物分子。

微細胞形態(tài)上呈一個穩(wěn)定的圓形，依然保持著由20多種脂多糖(內(nèi)毒素)組成的細胞壁結構[64]，類似于親代細菌。同時，微細胞有其親代細胞的除了染色體DNA以外的所有成分。

Lee等[65]用谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum)產(chǎn)生無內(nèi)毒素的微細胞。谷氨酸棒狀桿菌是革蘭氏陽性菌，其符合美國FDA食品添加劑的安全性指標。乳酸菌是一種有益菌，乳酸菌的革蘭氏陽性細胞壁主要由肽聚糖、磷壁酸、蛋白質(zhì)和多糖組成[66]。Giacalone等[64]將乳酸菌的微細胞作為遞藥載體，實驗證明其具有很好的安全性和生物相容性。

3.2 微細胞在藥物遞釋系統(tǒng)中的應用

微細胞可以通過EGFR、人類表皮生長因子受體Ⅱ(ERBB2)、CD33或CD3的雙特異性抗體靶向腫瘤細胞[45,67]。微細胞通過受體介導的內(nèi)吞作用進入腫瘤細胞，在體內(nèi)實驗中，裝載阿霉素的微細胞能夠抑制小鼠體內(nèi)乳腺、卵巢或肺部腫瘤生長[61]。Solomon等[68]已經(jīng)進行了裝載紫杉醇的微細胞的Ⅰ期臨床試驗，其表現(xiàn)出了良好的抗腫瘤活性，并且沒有導致促炎性因子的增加。MacDiarmid等[69]以17個不同品種的帶有晚期腦腫瘤的狗為模型，證明了微細胞載藥體系在腦腫瘤靶向和治療方面的巨大潛力。

Vinh等[70]和Nguyen等[71-72]將鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)和嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)通過葡萄糖和果糖產(chǎn)生最大尺寸小于400 nm的微細胞，并將其用于遞送順鉑、紫杉醇和頭孢菌素。MacDiarmid等[61]成功把siRNA和shRNA包封入來自鼠傷寒沙門氏菌的微細胞中，并通過BsAb靶向EGFR。Jivrajani等[73]利用由葉酸來修飾包封shRNA的微細胞靶向腫瘤細胞，再釋放shRNA抑制血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)，如圖3所示。

圖3 FAminicellsVEGFA制備的示意圖[73]Fig.3 Preparation of FA minicellsVEGFA[73]

4 結論與展望

細菌載體的出現(xiàn)為納米載藥系統(tǒng)的研發(fā)提供了新思路，為腫瘤治療提供新的途徑。其中，細菌衍生物載體具有更好的操控性和安全性，并在實驗中有很好的表現(xiàn)。但細菌衍生物載體畢竟還是一個嶄新的領域，很多細菌衍生物產(chǎn)生的機制和載藥的機制尚不明確，如何高效地把載體靶向至腫瘤組織或細胞，如何降低或消除細菌衍生物的毒性，這些問題都是未來的研究難點和重點。相信隨著生物工程技術和基因工程技術的不斷發(fā)展和完善，細菌衍生物載體技術會越來越成熟，最終運用至腫瘤患者的臨床治療中。