三維打印羥基磷灰石/磷酸三鈣骨支架工藝中粉體材料組分比及黏結(jié)劑對骨支架性能的影響

楊明明,汪焰恩,魏生民,魏慶華,柴衛(wèi)紅,李欣培

(西北工業(yè)大學(xué)機電學(xué)院，陜西西安710072)

由于成分組成及物理特性與自然骨中的無機礦物鹽很接近，磷酸鈣基生物陶瓷廣泛應(yīng)用于骨組織工程[1]。羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)是骨組織的主要無機礦物鹽，占整個干骨質(zhì)量的 60%～70%，并且具有良好的生物相容性和骨傳導(dǎo)性，但是純HA支架存在易脆、降解速度慢等缺點；磷酸三鈣(β-TCP)具有良好的生物降解性和生物相容性，植入體內(nèi)能逐漸降解,并被新生骨取代，但是β-TCP在生理環(huán)境下降解速度過快，力學(xué)強度低。當(dāng)前生物骨材料研究的熱點是通過多種磷酸鈣基材料混合制備性能優(yōu)良的復(fù)合支架材料，以克服單相生物骨材料缺陷。雙相鈣磷酸鹽(biphasic calcium phosphate， BCP)[2]是由兩個或更多的陶瓷相復(fù)合而成，可以克服單相陶瓷的缺點。

隨著骨組織工程的發(fā)展，出現(xiàn)了基于計算機輔助設(shè)計和制造的快速成型技術(shù)(rapid prototyping，RP)。利用快速成型技術(shù)[3]制備組織工程支架，可克服傳統(tǒng)方法制備人工骨支架尺寸精度不高、力學(xué)強度不佳、無法實現(xiàn)個性化定制骨支架和很難制備復(fù)雜結(jié)構(gòu)的骨支架等缺陷。三維打印[4](three dimension printing，3DP)是快速成型技術(shù)的一種，其工作原理是三維打印機讀取零件三維截面信息數(shù)據(jù)，通過控制噴嘴，噴灑黏結(jié)劑，選擇性地將生物骨材料黏在一起形成截面輪廓，層層遞進，最后得到零件整體。而在粉末黏結(jié)三維打印骨支架的制備過程中，黏結(jié)劑對支架的微觀結(jié)構(gòu)、力學(xué)性能、尺寸精度和生物相容性起到關(guān)鍵的作用，因此，在粉末黏結(jié)三維打印骨支架的制備過程中，黏結(jié)劑的合理選取顯得尤為關(guān)鍵。

近年來，各種HA/β-TCP復(fù)合比例已經(jīng)被研究，但是很少應(yīng)用于臨床[1]，最佳的HA/β-TCP復(fù)合比值也還沒有確定。Hench等[5]認為：對3D打印的酸性膠水溶液進行優(yōu)化可以改善骨支架的打印精度、力學(xué)強度和生物相容性。很少有人研究黏結(jié)劑-粉末系統(tǒng)。因此，新的黏結(jié)劑-粉末系統(tǒng)對于骨組織工程是非常關(guān)鍵的，這種黏結(jié)劑-粉末系統(tǒng)使得打印的骨支架具有良好的力學(xué)性能和生物相容性。

本研究中，筆者通過使用不同膠水(聚乙烯醇(PVA)和磷酸)制備具有不同HA/β-TCP比例的復(fù)合骨支架，并對骨支架的孔隙率、吸水性、力學(xué)性能、微觀結(jié)構(gòu)以及生物相容性等基本性質(zhì)進行實驗研究和探討，以期為三維粉末打印骨生物陶瓷支架基體材料和膠水的優(yōu)化、配比選擇提供工藝指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 材料

生物材料HA和β-TCP，購于西安博恩生物科技有限公司。HA 和β-TCP粉末的Ca/P化學(xué)組成比分別是1.67和1.5。稱量合適的HA和β-TCP，完全混合以制備理想的HA/β-TCP質(zhì)量配比(100∶ 0、20∶ 80、40∶ 60和60∶ 40)作為打印機粉料。此外，配制PVA(分子量為79 156，青島優(yōu)索化學(xué)科技有限公司)溶液和磷酸(85%，天津市百世化工有限公司)溶液作為3D打印機黏結(jié)劑用于制備骨支架。實驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)PVA黏結(jié)劑質(zhì)量分數(shù)為0.8%、磷酸黏結(jié)劑的質(zhì)量分數(shù)為8.75%時，骨支架的力學(xué)性能最佳，故本文中，筆者選用PVA黏結(jié)劑的質(zhì)量分數(shù)為0.8%，磷酸黏結(jié)劑的質(zhì)量分數(shù)為8.75%。

1.2 骨支架制備

使用三維建模CAD軟件設(shè)計大孔骨支架(高為3 mm、直徑為10 mm、孔隙率為70%、大孔直徑為600 μm)，并將其導(dǎo)出*.STL格式輸入到3D打印機(Zprinter 250,美國ZCorporation有限公司)，制備設(shè)計的骨支架模型，打印過程中鋪粉厚度為0.1 mm，黏結(jié)劑的控制用量為0.3 L/m2。待打印完畢，骨支架放在打印機中干燥2 h(干燥溫度維持在50 ℃)，然后取出試樣支架，去除未黏結(jié)的粉末，完成骨支架制備。圖 1(a)為用于 ZPrinter 250打印機的骨支架設(shè)計模型；圖1(b)為所打印的人工骨支架，其直徑、高度與設(shè)計尺寸(直徑φ=10.0 mm及高度H=3 mm)基本一致。

使用3D打印機制備兩組骨支架，根據(jù)使用的黏結(jié)劑命名為聚乙烯醇骨支架和磷酸骨支架。每組骨支架有4種不同HA/β-TCP比例的骨支架被制備。表1對不同成分的骨支架進行了標記。

表1 不同成分骨支架的標記

1.3 骨支架性能測試

1.3.1 吸水率

通過骨支架吸水率實驗來評價親水性。將骨支架置于去離子水中，利用ME203E型微量天平(梅特勒-托利多公司)每隔一段時間(5、10、30、60、120和240 min)測量骨支架質(zhì)量，稱質(zhì)量前用濾紙將骨支架表面自有液體吸出。最后根據(jù)測量數(shù)據(jù)計算骨支架的吸水率(bibulous rate)，吸水率[6]的計算見式(1)。

(1)

式中：m1為骨支架凈質(zhì)量；m2為骨支架各時間點所測量的質(zhì)量。

1.3.2 孔隙率

使用重量分析法測量骨支架的孔隙率(porosity)，其孔隙率P[7]的計算見式(2)。

P=(1-ρa/ρt)×100%

(2)

式中：ρa和ρt分別表示骨支架的實際密度和材料的理論密度，理論密度是指由HA粉體材料及黏結(jié)劑構(gòu)成的密實結(jié)構(gòu)所對應(yīng)的密度，經(jīng)測定，其值為3.08～3.17 g/cm3(HA和β-TCP的理論密度[8]分別為3.156和3.07 g/cm3)，骨支架的實際密度等于其總質(zhì)量除以總體積。

1.3.3 力學(xué)性能

利用CTM250型力學(xué)電子萬能試驗機(上海協(xié)強儀器制造有限公司)對樣件支架進行抗壓測試。加載時，壓頭速度2 mm/min，每組測6個樣件。

1.3.4 支架微觀特性

本研究使用X-MAX20/INCA 250型掃描電子顯微鏡(SEM，TESCAN公司)分別在100倍、200倍和500倍放大倍率下觀察人工骨支架的微觀形貌。

1.4 細胞增殖和分化實驗

選出生1個月的大鼠，麻醉處死，無菌條件下從脛骨中獲取骨髓間充質(zhì)干細胞，制成單細胞懸浮液，接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，放置在37 ℃、體積分數(shù)5% CO2、相對濕度95%的環(huán)境下培養(yǎng)，達到85%鋪滿，胰酶進行消化傳代，1×104個/cm2的細胞密度接種，每隔2 d換培養(yǎng)液。第3代細胞被用于后續(xù)試驗。

將8種支架分別置于100%酒精溶液中浸泡24 h處理，然后分組放入24孔培養(yǎng)板內(nèi)。用完全培養(yǎng)基將第3代骨髓間充質(zhì)干細胞制成細胞懸液調(diào)整成2×106個/mL細胞濃度的懸浮液，并往裝有骨支架的孔內(nèi)分別滴加10 μL骨髓間充質(zhì)干細胞懸液。而后靜置于37 ℃、5% CO2、相對濕度95%的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)，3 h 后取出并翻轉(zhuǎn)骨支架，再滴加 10 μL骨髓間充質(zhì)干細胞懸液，并繼續(xù)置于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)靜置3 h。之后向裝有骨支架樣本的培養(yǎng)孔內(nèi)分別添加質(zhì)量分數(shù)為10%磷酸鹽緩沖液(PBS)的完全培養(yǎng)基，每隔2 d對培養(yǎng)基進行更換。分別于細胞接種骨支架后3、7和14 d將骨支架取出(每組樣本數(shù)為6)，用無菌PBS沖洗后重新放置于新24孔板內(nèi)，按照CCK-8細胞增殖檢測試劑盒的說明進行操作，最后將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至96孔板內(nèi)，并通過紫外酶標儀450 nm測定其吸光度。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)分析，實驗結(jié)果以均值±標準差(x±s)表示，統(tǒng)計結(jié)果采用方差分析及q檢驗，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 HA/β-TCP的比例對骨支架吸水性的影響

記錄兩組支架不同時間的質(zhì)量，根據(jù)式(1)計算兩組支架的吸水率，圖2為兩組支架吸水率-時間的曲線。由圖2可知：在這兩組支架中，HA/β-TCP的比例對支架的親水性沒有明顯影響。磷酸骨支架的平均吸水率為173%，然而聚乙烯醇支架的平均吸水率是248%。顯然，就吸水率而言，聚乙烯醇骨支架的親水性更好，這是由于聚乙烯醇有高的吸水性。

H-聚乙烯醇，P-磷酸圖2 HA/β-TCP比例對骨支架 吸水率的影響Fig.2 Effects of different HA/β-TCP ratios on bibulous rate of scaffolds (P-polyvinyl alcohol scaffolds, H-phosphoric acid scaffolds)

2.2 HA/β-TCP的比例對骨支架孔隙率的影響

孔隙率的測量是為了評價骨支架的設(shè)計孔隙率與實際孔隙率的差別，這個信息對于定制骨支架起到關(guān)鍵作用。圖3為兩組支架孔隙率測量結(jié)果。由圖3可知：骨支架的實際孔隙率與設(shè)計的孔隙不一致。對于聚乙烯醇骨支架，骨支架的實際孔隙率明顯低于設(shè)計孔隙率 (p<0.05)。然而，磷酸骨支架樣件的實際孔隙率呈現(xiàn)出少于5%的偏差。結(jié)果表明膠水對孔隙率的打印精度有明顯影響。此外，骨支架的孔隙是由兩部分組成的：一部分是設(shè)計的孔隙，另一部分是粉體材料堆積時顆粒之間的微小空隙。無論是聚乙烯醇骨支架還是磷酸骨支架，樣件的實際孔隙率都低于設(shè)計的孔隙率，這可以歸因于支架內(nèi)部沒黏結(jié)的粉末沒能充分去除。

虛線為設(shè)計孔隙率(70%)，*表示聚乙烯醇骨支架孔隙率低于設(shè)計孔隙率圖3 HA用量對骨支架孔隙率的影響Fig.3 Effects of HA concentration on the scaffold porosity

2.3 力學(xué)性能分析

經(jīng)抗壓強度測量，兩組支架的抗壓強度如表2所示。由表2可知，顯然磷酸骨支架抗壓性能明顯優(yōu)于聚乙烯醇骨支架。單位化柱狀圖(圖4)可以更好地表述不同材料配比及黏結(jié)劑選用對支架結(jié)構(gòu)性能的影響。由圖4可知：對于磷酸骨支架，其平均抗壓強度σbc度為4.7 MPa，當(dāng)HA與β-TCP的比例為40∶ 60和60∶ 40時，抗壓強度σbc分別是(4.9±0.20)和(4.84.8±0.23)MPa，而彈性模量E則為75～200 MPa，當(dāng)HA與β-TCP的比例為60∶ 40時，骨支架彈性模量取得最大值(200 MPa)。聚乙烯醇骨支架的平均抗壓強度則為2.7 MPa，彈性模量為30～60 MPa。此結(jié)果表明，適當(dāng)?shù)腍A與β-TCP復(fù)合比例可明顯提高骨支架的力學(xué)特性。

表2 骨支架的力學(xué)特性

Rouvillain等[9]認為TCP對支架強度起關(guān)鍵作用，骨支架力學(xué)強度隨著β-TCP含量增加而降低。然而，本研究結(jié)果表明，骨支架的強度和β-TCP含量不存在簡單的單調(diào)關(guān)系，制造方法等其他因素對支架的強度的影響不可忽略。

不同黏結(jié)劑的使用對骨支架力學(xué)強度有著很大影響。顯然，筆者所研究的2組骨支架力學(xué)性能有很大差別。由于聚乙烯醇的黏度遠大于磷酸，降低了聚乙烯醇的流動性及浸潤特性，進而影響了其黏結(jié)生物陶瓷粉末的強度。

人們普遍認為，人工骨支架應(yīng)該具有與自然骨相似的力學(xué)特性。松質(zhì)骨的抗壓強度是2 ～12 MPa[10]，因此磷酸骨支架的力學(xué)特性更接近于松質(zhì)骨。

圖4 骨支架力學(xué)性能單位化柱狀圖Fig.4 Normalized bar graph of scaffolds mechanical properties

2.4 骨支架微觀結(jié)構(gòu)

通過不同放大倍數(shù)的掃描電鏡探究人工骨支架的微觀形態(tài)，可以看出3D打印磷酸人工骨支架的支架內(nèi)部富含多孔結(jié)構(gòu)，骨支架的SEM照片如圖5所示。由圖5可知：由HA和β-TCP均勻混合黏結(jié)成的人工骨支架，其實際大孔尺寸與設(shè)計的大孔尺寸非常接近(圖5(a))。由圖5(b)及圖5(c)可以看出：所打印骨支架上遍布HA和β-TCP顆粒形成的2～30 μm微孔。由圖5(d)可以看出：聚乙烯醇骨支架微觀形態(tài)與磷酸骨支架的形態(tài)非常相似，但聚乙烯醇骨支架的實際大孔尺寸略小于設(shè)計尺寸，這主要是由于聚乙烯醇具較大的黏度影響了流動性，造成了內(nèi)部部分顆粒未能黏結(jié)牢固，坍塌或堵塞了部分內(nèi)部孔道。另外，從圖5(e)、圖5(f)可以觀察到聚乙烯醇骨支架上同樣布滿2～30 μm的微孔，與磷酸骨支架內(nèi)部的微孔差異很小，這說明支架內(nèi)部微孔形成于粉末與粉末之間，主要由粉末原材料尺寸決定。由于本文打印磷酸骨支架和聚乙烯醇骨支架所用粉末材料相同(均為HA和β-TCP)，故兩組骨支架內(nèi)部微孔結(jié)構(gòu)尺寸非常相似。圖5結(jié)果表明，使用2種不同黏結(jié)劑制備的骨支架表面形態(tài)相似，均具有粗燥的外表面和實驗表面，這種不規(guī)則微觀表面有利于細胞黏附[11]。聚乙烯醇骨支架內(nèi)部的設(shè)計大孔出現(xiàn)了堵塞現(xiàn)象。同時，2種骨支架內(nèi)部均布滿2～30 μm由HA、β-TCP顆粒材料堆積形成的微孔，這種隨機微孔構(gòu)成了次級連通孔隙網(wǎng)絡(luò)，這些次級微孔連同設(shè)計大尺寸孔隙網(wǎng)絡(luò)可有效完成營養(yǎng)物質(zhì)的輸送，從而促進成骨細胞向支架內(nèi)部的攀爬及維持內(nèi)部細胞的新陳代謝。大量實驗表明，用于輸送營養(yǎng)物質(zhì)到支架內(nèi)部的的連通孔隙網(wǎng)絡(luò)是維持和促進支架內(nèi)骨細胞生長發(fā)育的關(guān)鍵因素[12-13]。

(a)和(d)分別是磷酸骨支架放大100倍和200倍的SEM；(b)和(e)分別為聚乙烯醇骨支架放大100倍和200倍SEM；(d)和(f)中分別是圖(b)和(e)中紅色矩形區(qū)域500倍SEM；此外，圖中黃圈內(nèi)為粉末顆粒間的微孔，紅圈部分為設(shè)計孔道圖5 骨支架的SEM照片F(xiàn)ig.5 SEM images of bone scaffolds

2.5 細胞增殖和分化結(jié)果

為了評價所制備骨支架的生物兼容性，將小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞分別在8種骨支架上培養(yǎng)3、7和14 d后，測量、觀察各骨支架細胞增殖的吸光值(OD值)，結(jié)果如圖6所示。由圖6可看出：8組支架上均能夠培養(yǎng)小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞。開始前 3 d，8種支架的 OD 值均在上升，到第7天測量時，8種支架 OD 值均大于第3天測量值，其中H6040支架的 OD值是磷酸骨支架中達到最大的(分別為H100、H2080和H4060 的 222.58%、127% 和 106.15%)；而P6040支架的 OD值則在聚乙烯醇骨支架中達到最大(分別為P100、P2080和P4060 的 234.28%、115.49% 和 103.79%)。無論是磷酸骨支架還是聚乙烯醇骨支架，當(dāng)HA和β-TCP的復(fù)合比例為60∶ 40時，骨支架的OD值達到最大值，表明HA和β-TCP復(fù)合比例為60∶ 40的人工骨支架更加有利于細胞生長。此外，第14天測量結(jié)果表明8組支架的 OD值均小于第7天時的測量值，即培養(yǎng)后期所有支架的OD值均呈現(xiàn)下降趨勢，這是由于經(jīng)過前期的培養(yǎng)，細胞逐漸成熟并進入礦化階段(mineral stage)，從而導(dǎo)致 OD值減少。由于8種支架的OD值在前 7 d均呈上升趨勢，因此所制備的8種支架均具有骨生長及骨化能力。

3 結(jié)論

首先使用 3D打印技術(shù)制備了具有連通孔道的HA/β-TCP骨支架，為了比較不同黏結(jié)劑及復(fù)合比例對骨支架性能的影響，分別選用磷酸和聚乙烯醇制備了不同復(fù)合比例的骨支架。其次，通過測量孔隙率、強度試驗、電鏡掃描及細胞培養(yǎng)試驗，分別從微觀結(jié)構(gòu)、力學(xué)性能及生物兼容性方面分析了所制備各組骨支架的性能。試驗結(jié)果表明，使用磷酸作為黏結(jié)劑的骨支架具有更加優(yōu)越的力學(xué)性能和微觀結(jié)構(gòu)，細胞培養(yǎng)實驗更進一步表明磷酸骨支架比聚乙烯醇骨支架具有更好的生物相容性?；诒疚慕Y(jié)果，磷酸骨支架(H6040)更有可能在臨床試驗中取得成功。

本研究將HA與β-TCP制備成復(fù)合材料，可集兩單組分材料的優(yōu)點，彌補二者各自的缺陷，是一種性能優(yōu)良的生物骨材料。因此，HA/β-TCP合適的復(fù)合比例對于磷酸鈣材料在組織工程的應(yīng)用提供了有利條件。