基于UPLC-Q-TOF MS研究煨制 對雷公藤化學成分的影響

劉建群，羅素花，張 銳，舒積成，楊瑞昆，閆 君

(江西中醫(yī)藥大學現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室，江西 南昌 330004)

雷公藤(TripterygiumwilfordiiHook. f.)為衛(wèi)矛科雷公藤屬植物[1]，其根可藥用，具有清熱解毒、祛風通絡、舒筋活血、消腫止痛、殺菌止血之功效[2]，臨床上主要用于腎病綜合征、類風濕關節(jié)炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病[3-4]。但雷公藤具有肝、腎、心、消化系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)等毒性[5]，是近年來毒副作用和不良反應報道最多的中藥之一，這嚴重制約了它的臨床應用推廣。雷公藤的主要有效成分包括二萜、三萜和生物堿等，多數(shù)具有毒性，如雷公藤甲素、雷公藤紅素和雷公藤次堿等[6-9]。

古云“有毒宜制”，炮制是降低中藥毒性的傳統(tǒng)有效方法。有文獻報道[10]，從減毒效果來看，雷公藤煨制、米醋蒸制和藥汁制可能具有較好的應用前景。其中，烘箱煨制、萊菔子汁炮制和羊血燉能提高雷公藤抗炎效果；蒸制、甘草汁制和雙向固體發(fā)酵能保持雷公藤抗炎效果；水煮與微波煨制則會降低甚至消除雷公藤抗炎效果。目前，對雷公藤炮制后的化學成分研究較少，僅見對個別成分的分析，而未見對雷公藤化學成分整體、系統(tǒng)的研究。

本課題組[11]研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤經200 ℃烘箱中煨制后，在減毒、增效以及工藝可控性三方面均有較大優(yōu)勢，值得深入研究。為闡明雷公藤烘箱煨制減毒、增效的物質基礎，提高雷公藤臨床應用的安全性與有效性，本工作擬采用UPLC-Q-TOF MS技術結合主成分分析(PCA)法和正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)法對雷公藤煨制前后的化學成分變化進行系統(tǒng)研究。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

島津LC-30A液相色譜儀：日本島津公司產品；AB Sciex Triple TOF 5600質譜儀：美國AB Sciex公司產品；Agilent 1260 高效液相色譜儀：美國Agilent公司產品；GZX-9140 MBF數(shù)顯鼓風干燥箱：上海博訊實業(yè)有限公司產品；PS-40潔康超聲儀：東莞市潔康超聲波設備有限公司產品；BT25S型十萬分之一電子天平：德國Sartorius公司產品；Milli-Q超純水制備儀：美國Millipore公司產品。

甲醇：色譜純，迪馬公司產品；甲酸：色譜純，阿拉丁公司產品；乙腈：色譜純，ACS公司產品；實驗用水為Milli-Q超純水；氯化鈉、乙醇、鹽酸、氨水、乙醚：均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司產品。雷公藤根藥材：采自江西萍鄉(xiāng)市，經劉建群教授鑒定為衛(wèi)矛科雷公藤屬植物雷公藤(TripterygiumwilfordiiHook. f.)。雷公藤甲素、雷公藤內酯酮、雷公藤次堿、雷公藤吉堿、雷酚內酯、去甲澤拉木醛、雷公藤內酯甲、雷公藤紅素對照品：含量均大于98%，鄭州豐耀農業(yè)科技有限公司產品；南蛇藤肉桂酰胺堿、tripfordine A、雷酚新內酯苷、雷公藤定堿、1-羥基-2,5,8-三甲基-9-芴酮、25(9→8),26(13→14)Abeo-24-nor-8,14-seco-friedelan-2,3-dihydroxy-1,3,5(10),6,8-pentaen-29(13)-olide對照品：由本實驗室分離制得，經HPLC檢測，純度均大于98%。

1.2 供試品溶液的制備

1.2.1雷公藤藥材及其煨制品溶液的制備

分別稱取2份各10 g藥材，作為生品和煨制品組。煨制品按以下方法制備：取曬干后的黃土過4號篩，按每4 g黃土中加入1 mL 10%食鹽水的比例混勻得到黃泥，用錫箔紙包住藥材，再用黃泥均勻包裹，晾干后置于200 ℃烘箱中煨制45 min，剝離黃泥即得。將生品和煨制品粉碎，用100 mL甲醇超聲提取30 min，取1 mL上清液，過0.22 μm有機濾膜，得生品和煨制品溶液，采用同樣的方法制備平行樣品溶液各10份。

1.2.2雷公藤總生物堿及其煨制品溶液的制備 稱取40 g雷公藤藥材，加入700 mL 95%乙醇，超聲提取30 min，過濾，將濾液減壓蒸干。向殘渣中加入300 mL 1%鹽酸溶液溶解，過濾，向濾液中加10 mL濃氨水調節(jié)pH 9，用400 mL乙醚萃取，揮干乙醚液，得到總生物堿。精密稱取12 mg總生物堿2份，其中1份用10 mL甲醇溶解，過0.22 μm濾膜，得總生物堿溶液；另一份按照 1.2.1節(jié)方法煨制后，制得總生物堿煨制品溶液。

1.2.3雷公藤次堿、雷公藤紅素及其煨制品溶液的制備 稱取約14 mg雷公藤次堿和雷公藤紅素對照品各2份，其中1份用10 mL甲醇溶解，過0.22 μm濾膜，得雷公藤次堿和雷公藤紅素溶液；另一份按照1.2.1節(jié)方法煨制后，用同樣的方法制得雷公藤次堿和雷公藤紅素煨制品溶液。

1.3 實驗條件

1.3.1色譜條件 色譜柱：Thermo C18柱(100 mm×2.1 mm×2.2 μm)；流動相：A為0.1%甲酸-水溶液，B為乙腈；梯度洗脫程序：0～30 min(5%～60%B)，30～52 min(60%B)，52～57 min(60%～100%B)，57～60 min(100%B)；60～60.1 min(100%～5%B)，60.1～63 min(5%B)；流速0.3 mL/min；進樣量5 μL；柱溫30 ℃。

1.3.2質譜條件 離子源噴霧電壓5 500 V；離子源溫度600 ℃；裂解電壓100 V；碰撞能量55 eV，碰撞能量擴展為20 eV；霧化氣為N2；輔助氣壓力：GS1，GS2均為0.41 MPa，氣簾氣(CUR)壓力0.24 MPa；母離子掃描范圍m/z100～1 000。

1.4 樣品測定及數(shù)據(jù)分析

取制備好的雷公藤藥材及其煨制品溶液各10份，進行UPLC-Q-TOF MS分析。得到的質譜數(shù)據(jù)經Marker View軟件處理后，將數(shù)據(jù)導入SIMCA-P 14.1統(tǒng)計軟件，進行PCA和OPLS-DA分析。以同樣的方法將制備好的總生物堿、雷公藤次堿、雷公藤紅素及其煨制品、混合對照品溶液進行分析。

2 結果與討論

2.1 UPLC-Q-TOF MS圖譜分析

正離子模式下，雷公藤藥材、總生物堿、雷公藤次堿、雷公藤紅素及各自煨制品的基峰強度離子流圖(BPI)示于圖1。對比可知，煨制后各成分發(fā)生了顯著變化。煨制后，雷公藤次堿(26.176 min)的色譜峰面積減小；雷公藤紅素(35.273 min)的色譜峰消失，結合MS分析發(fā)現(xiàn)，產生了多個降解(27.145，32.550，34.330 min等)和重排化合物(36.315，40.209，41.587 min等)。對比雷公藤藥材、總生物堿、雷公藤紅素煨制前后的BPI圖，發(fā)現(xiàn)雷公藤藥材煨制后，保留時間為6.566、8.655、12.117、25.119、34.334 min等的色譜峰消失；保留時間為25.720、26.591 min等的色譜峰面積增加；保留時間為35.587、35.859 min等是新產生的色譜峰。通過與總生物堿和雷公藤紅素BPI圖比較，推測6.566、8.655 min峰為生物堿類成分，34.334 min為雷公藤紅素。雷公藤總堿煨制后，保留時間在4～10 min、20～25 min的多個色譜峰消失。

圖1 雷公藤藥材生品(a)及其煨制品(b)，雷公藤總生物堿(c)及其煨制品(d)， 雷公藤次堿(e)及其煨制品(f)，雷公藤紅素(g)及其煨制品(h)的BPI圖Fig.1 BPI of untreated (a, c, e, g) and processed (b, d, f, h) Tripterygium wilfordii, total alkaloid, wilforine and celastrol

2.2 PCA分析

雷公藤藥材生品及其煨制品的UPLC-Q-TOF MS數(shù)據(jù)PCA分析得分圖示于圖2。每個點代表1個樣品，橫、縱坐標分別為第一、第二主成分得分?？梢钥闯?，雷公藤生品及其煨制品在第一主成分得分上分別聚向橫軸的相反方向，表明二者的UPLC-Q-TOF MS數(shù)據(jù)差異特征明顯。

圖2 雷公藤生品(a)和煨制品(b)的PCA得分圖Fig.2 Score plots of PCA for untreated (a) and processed (b) Tripterygium wilfordii

圖3 雷公藤生品和煨制品的 OPLS-DA差異成分的S-plot曲線Fig.3 S-plot curve of OPLS-DA for untreated and processed Tripterygium wilfordii

2.3 OPLS-DA分析

雷公藤生品及其煨制品的UPLC-Q-TOF MS數(shù)據(jù)OPLS-DA分析的S-plot圖示于圖3。S-plot圖中每個點代表1個變量，即位于某保留時間的某質荷比信號。橫坐標代表變量的貢獻度(協(xié)方差)，縱坐標代表變量的相關性(可信度)，在-1～1之間取值。雷公藤生品及其煨制品之間差異顯著的分子離子峰分布于S曲線的兩端，S曲線的右上角代表雷公藤煨制后含量升高的化合物的分子離子峰，S曲線的左下角代表雷公藤煨制后含量降低的化合物的分子離子峰，越靠近S曲線兩端的點，所代表的分子離子峰對兩組樣品間的差異貢獻越大。

通過分析OPLS-DA模型，并結合雷公藤生品煨制前后的BPI譜圖，共發(fā)現(xiàn)81種化學成分的含量具有顯著性差異。

2.4 雷公藤生品及其煨制品差異性成分鑒定

根據(jù)化合物質譜裂解規(guī)律，結合文獻及對照品對照對煨制前后的81種差異成分進行結構解析，鑒定出其中35種化合物[12-30]，列于表1，并推測了其余48種成分的結構類型及來源。鑒定的35種化合物中，包含27種生物堿和5種三萜，煨制后有26種成分含量降低，7種成分含量升高，2種為新生成的化合物。將鑒定的每種化學成分在雷公藤生品與煨制品中峰面積的比值作為量化指標，能夠反映出35種差異性化學成分的量變趨勢及幅度。煨制前后峰面積差異較大的代表性化合物包括雷公藤紅素、南蛇藤糠酰胺堿和1-去乙?；坠俣▔A，其可能的二級質譜裂解途徑示于圖4。其余48種成分中，含有29種生物堿，5種三萜；煨制后25種成分含量下降，21種成分含量增加，推測煨制后17種成分來源于生物堿，4種成分來源于雷公藤紅素。綜上，煨制后含量顯著變化的成分大部分為生物堿，占69%；其次為三萜，占12%。由此推測，生物堿和雷公藤紅素的變化可能是雷公藤煨制減毒增效的物質基礎。

3 結論

采用UPLC-Q-TOF MS結合PCA法、OPLS-DA法系統(tǒng)研究了煨制對雷公藤化學成分的影響，發(fā)現(xiàn)雷公藤煨制后有81種化學成分含量變化顯著，鑒定了其中35種成分，這些化合物絕大部分為生物堿，其次為三萜(含雷公藤紅素)。由于生物堿和雷公藤紅素均為雷公藤抗炎的有效成分，且毒性較大，因此，生物堿和雷公藤紅素的變化可能是雷公藤煨制減毒增效的物質基礎。該研究可為研發(fā)新的抗類風濕性關節(jié)炎的先導化合物提供參考。

表1 UPLC-Q-TOF MS鑒定的35種雷公藤煨制前后的顯著性差異化合物Table 1 35 significant difference constituents in untreated and processed Tripterygium wilfordii based on UPLC-Q-TOF MS

續(xù)表1

注：↓表示煨制后化合物含量降低；↑表示煨制后化合物含量升高

圖4 雷公藤紅素(a)、南蛇藤糠酰胺堿(b)和1-去乙?；坠俣▔A(c)的二級質譜裂解途徑Fig.4 MS/MS fragmentation pathways of celastrol (a), celafurine (b) and 1-desacetylwilfordine (c)