UPLC-LTQ-Orbitrap-MS法 快速分析鬼箭羽中的化學(xué)成分

姬瑞芳，全慶華，郭曉宇，張伽妹，王政霖，宋勇麗，田婧鋆， 孫倩倩，譚 鵬，韓 靜，劉永剛

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102)

鬼箭羽(Euonymusalatus)[1-2]為衛(wèi)矛科Celatraceae衛(wèi)矛屬植物衛(wèi)矛，為具翅狀物的枝條或翅狀附屬物，史載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其性寒、味苦、辛，歸肝、脾經(jīng)。藥理研究表明[3]，鬼箭羽具有降血糖、調(diào)血脂及延緩動(dòng)脈粥樣硬化等作用，可治療糖尿病[4]、高脂血癥、慢性腎病等多種內(nèi)科病癥，單用或組方應(yīng)用均有很好的療效。通過(guò)提取、分離技術(shù)得到鬼箭羽中含有的化合物類型包括[5-8]：糖、強(qiáng)心苷、有機(jī)酸、五環(huán)三萜、黃酮、黃酮苷、三萜、酚酸、脂肪族、生物堿等。據(jù)文獻(xiàn)[9]報(bào)道，黃酮類成分具有很強(qiáng)的活性氧自由基清除功能，是鬼箭羽藥材的主要活性成分之一。

中藥材的化學(xué)成分復(fù)雜，應(yīng)用傳統(tǒng)的提取、分離、純化技術(shù)從中藥材中獲得單體化學(xué)成分的方法繁瑣、費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，且很難分離得到含量較低或結(jié)構(gòu)相似的化學(xué)成分。液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)聯(lián)用技術(shù)[10-11]與傳統(tǒng)方法相比，具有分離快速、鑒定準(zhǔn)確、適用于檢測(cè)未知化合物等優(yōu)點(diǎn)。目前，對(duì)鬼箭羽中化學(xué)成分的研究?jī)H限于傳統(tǒng)的分離手段和半制備色譜法等，未見(jiàn)LC-MS法檢測(cè)鬼箭羽化學(xué)成分的報(bào)道。

本研究擬利用UPLC-LTQ-Orbitrap-MS技術(shù)對(duì)鬼箭羽中多種組分進(jìn)行快速識(shí)別，通過(guò)查閱文獻(xiàn)，總結(jié)各類化合物的裂解規(guī)律，建立各類化合物的識(shí)別方法，為鬼箭羽化學(xué)成分的研究提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝置

Accele 600 Pump高效液相色譜儀和LTQ-Orbitrap XL線性離子阱-串聯(lián)靜電軌道場(chǎng)質(zhì)譜儀：配有電噴霧離子源和Xcalibur 2.1工作站，美國(guó)Thermo Fisher公司產(chǎn)品；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；BT125D十萬(wàn)分之一型電子天平：德國(guó)Satorious公司產(chǎn)品。

1.2 主要材料與試劑

鬼箭羽藥材：北京三和藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，鬼箭羽具翅狀物的枝條，產(chǎn)自河北，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉勇教授鑒定為鬼箭羽。

甲醇：分析純，北京化工廠產(chǎn)品；乙腈、甲酸：質(zhì)譜純，美國(guó)Thermo Fisher公司產(chǎn)品；實(shí)驗(yàn)用水：娃哈哈純凈水。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1色譜條件 色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH C18柱(2.1 mm×50 mm×1.7 μm)；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；干燥氣(N2)流速10 L/min；柱溫25 ℃；流動(dòng)相：A為乙腈，B為0.1%甲酸水溶液；梯度洗脫程序：0～18 min(5%～21%A)， 18～35 min(21%～34%A)，35～42 min(34%～38%A)，42～52 min(38%～65%A)，52～70 min(65%～95%A)。

1.3.2質(zhì)譜條件 ESI離子源；負(fù)離子檢測(cè)模式；質(zhì)量掃描范圍m/z50～2 000；離子源溫度350 ℃；電離源電壓4 kV；管透鏡電壓110 V；霧化壓力275.86 kPa；毛細(xì)管電壓3 000 V；鞘氣和輔助氣均為高純氮?dú)?純度>99.99%)，鞘氣流速40 L/h，輔助氣流速20 L/h。

1.4 供試樣品的制備

精密稱取約1 g鬼箭羽藥材粉末于50 mL錐形瓶中，用25 mL甲醇溶液溶解，超聲1 h，過(guò)濾，共提取3次，將得到的濾液減壓濃縮至25 mL，取上清液過(guò)0.45 μm微孔濾膜，即得供試品。

2 結(jié)果與討論

2.1 鬼箭羽甲醇提取物的UPLC-LTQ-Orbitrap-MS分析

在負(fù)離子模式下，供試品的總離子流圖示于圖1。由圖可得化合物的精確分子質(zhì)量以及二級(jí)質(zhì)譜碎片離子信息，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，共鑒定得到65種成分，包括36種黃酮類、4種酚酸類、7種三萜類、12種脂肪族和6種其他類成分，其中，有28種化合物為首次在鬼箭羽中發(fā)現(xiàn)。65種化合物的詳情列于表1。

2.2 鬼箭羽中酚酸及其酯類成分的UPLC-LTQ-Orbitrap-MS分析

從鬼箭羽中共鑒定得到4種酚酸類成分、1種酚酸酯類成分。酚酸類成分極性較大，保留時(shí)間較短，容易丟失羧基；酚酸酯類成分容易失去酯基。以化合物8為例，在負(fù)離子模式下，準(zhǔn)分子離子峰為m/z167.03[M-H]-，其二級(jí)質(zhì)譜圖示于圖2。碎片離子m/z122.94、151.89和107.7分別為其母離子丟失羧基、甲基和同時(shí)丟失羧基與甲基所得，結(jié)合文獻(xiàn)[12]，可推斷化合物8為香草酸，其可能的裂解途徑示于圖3。

化合物11和12具有相同的準(zhǔn)分子離子峰m/z192.99 [M-H]-，其分子式均為C10H10O4，可能互為同分異構(gòu)體?；衔?1的碎片離子中存在m/z148.95 [M-H-COOH]-，表明取代基中存在羧基，據(jù)此判斷為阿魏酸?；衔?2的碎片離子不存在m/z148.95[M-H-COOH]-，但存在m/z133.92[M-H-CO2-CH3]-，推斷其為咖啡酸甲酯。

圖1 鬼箭羽的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of Euonymus alatus

序號(hào)No.保留時(shí)間tR/min 準(zhǔn)分子離子Molecularions (m/z)碎片離子Fragment ions (m/z)分子式Molecularformulas 鑒定結(jié)果Results1* 1.26503.16431.11[M-H-C2O3]-,C23H20O13異牡荊素草酸酯341.14[M-H-C5H6O6]-21.31 341.03 179.02[M-H-C6H10O6]- C12H22O12蔗糖[12]3 1.68 169.01 125.01[M-H-CO2]-C7H6O5 沒(méi)食子酸[12]4*3.83577.12559.15[M-H-H2O]-C30H26O12原矢車菊素B5* 6.17 137.02 108.94[M-H-CO]-C7H6O3原兒茶醛[12]66.19179.00135.01[M-H-CO2]-C9H8O4咖啡酸[12]76.20137.0292.86[M-H-CO2]-C7H6O3對(duì)羥基苯甲酸8 6.55167.03 151.86[M-H-CH3]- ,C8H8O4香草酸[12]122.74[M-H-CO2]-97.13289.07245.10[M-H-CO2]-C15H14O6兒茶素10*7.14561.14543.20[M-H-H2O]-C30H25O11原矢車菊素B衍生物11 8.06192.99148.95[M-H-CO2]-C10H10O4阿魏酸[12]12 8.43192.99133.92[M-H-CO2-CH3]-C10H10O4 咖啡酸甲酯13*9.24289.07245.08[M-H-CO2]-C15H14O6表兒茶素1410.79 609.41301.38[M-H-C12H20O9]-,C27H30O16蘆丁[13]273.12[M-H-C12H20O9-CO]-15*11.13 609.14463.09[M-H-C6H10O4]-,C28H34O15槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖301.23[M-H-C6H11O4-C6H11O5]-(1,2)-α-L-鼠李素苷 1611.15 609.14301.00[M-H-C6H11O4-C6H11O5]-C28H34O15橙皮苷1711.68 579.13433.10[M-H-C6H10O4]-C27H32O14柚皮苷1812.34575.12557.45[M-H-H2O]-,C30H24O12氫雙兒茶精A449.12[M-H-C6H6O3]-1912.66595.13301.07[M-H-C6H10H5-C5H8H4]-C26H28O16槲皮素-3-半乳糖-木糖苷2012.72593.13285[M-H-C12H20O9]-C27H30O15山奈酚-3-O-β-D-蕓香糖苷21* 13.16593.13447.20[M-H-C6H10O4]-,C27H30O15山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖基285.13[M-H-C6H10O4-C6H10O5]-(1,2)-α-L-鼠李糖22*13.57593.13447.21[M-H-C9H5O2]-,C30H26O13銀鍛苷285.11[M-H-C9H5O2-C6H10O5]-23*13.66623.16477.18[M-H-C6H10O4]-,C28H32O16異鼠李素-3-O-β-D-葡萄315.09[M-H-C6H10O4-C6H10O5]- (1,2)-α-L-鼠李糖苷 24*13.92 463.09301.08[M-H-C6H10O5]-C21H20O12槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷25*14.31623.16315.08[M-H-C12H20O9]-C28H32O16異鼠李素-3-O-β-D-蕓香糖2614.25463.09301.00[M-H-C6H10O5]-C15H9O7金絲桃苷[12]27*14.65463.09300.04[M-H-C6H11O5]-,C21H20O12異槲皮苷[12]301.00[M-H-C6H10O5]-

續(xù)表1

續(xù)表1

注：*為首次在鬼箭羽中發(fā)現(xiàn)的化合物

圖2 負(fù)離子模式下，化合物8的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.2 MS2 spectrum of compound 8 at negative ion mode

圖3 負(fù)離子模式下，香草酸可能的質(zhì)譜裂解途徑Fig.3 Fragmentation pathway of vanillic acid at negative ion mode

2.3 鬼箭羽中黃酮類成分的UPLC-LTQ-Orbitrap-MS分析

黃酮類化合物容易丟失C環(huán)中的羰基和氧原子等，還容易發(fā)生不同部位的反迪爾斯-阿德?tīng)?RDA)裂解，生成碎片離子m/z151。黃酮苷類化合物則先丟失糖基，形成相應(yīng)的苷元后再進(jìn)一步裂解。根據(jù)黃酮類化合物的裂解規(guī)律以及查閱相關(guān)文獻(xiàn)[12-15]，在鬼箭羽中最終鑒定得到36種黃酮類成分。由于不同類型的黃酮類化合物在C環(huán)產(chǎn)生RDA裂解的位置不同，因此分情況討論。

正黃酮類化合物在C環(huán)的1,3鍵或1,4鍵斷裂產(chǎn)生RDA裂解。在負(fù)離子模式下，峰42的準(zhǔn)分子離子峰為m/z150.90[M-H]-，其二級(jí)質(zhì)譜圖示于圖4a，C環(huán)發(fā)生1,3鍵斷裂，生成碎片離子m/z150.90、116.91，形成[A1,3]和[B1,3]碎片離子。母離子m/z269.04分別失去H2O、C2H2O、CO2產(chǎn)生碎片離子m/z251.07、226.92、225.03。A環(huán)丟失C3O2后經(jīng)氫重排得到的離子結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，故發(fā)生C環(huán)開(kāi)環(huán)后，丟失C2H2O形成穩(wěn)定共軛結(jié)構(gòu)的離子m/z158.76，根據(jù)文獻(xiàn)[19]推斷其為芹菜素，屬于正黃酮類化合物，其可能的裂解途徑示于圖5。

圖4 負(fù)離子模式下，鬼箭羽中峰42(a)，峰38(b)，峰41(c)的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.4 MS2 spectra of peak 42 (a), peak 38 (b) and peak 41 (c) at negative ion mode

圖5 負(fù)離子模式下，芹菜素可能的質(zhì)譜裂解途徑Fig.5 Fragmentation pathway of apigenin at negative ion mode

黃酮醇類化合物在C環(huán)的1,2鍵或1,3鍵斷裂產(chǎn)生RDA裂解。在負(fù)離子模式下，峰38的準(zhǔn)分子離子峰為m/z301.00[M-H]-，其二級(jí)質(zhì)譜圖示于圖4b，準(zhǔn)分子離子失去CO2產(chǎn)生碎片離子m/z257.18；碎片離子m/z178.97、150.90是其C環(huán)分別發(fā)生1,2和1,3鍵斷裂，形成[A1,2]和[A1,3]的碎片離子。根據(jù)文獻(xiàn)[12]推斷其為槲皮素，屬于黃酮醇類化合物，可能的裂解途徑示于圖6。

二氫黃酮類化合物在C環(huán)的1，3鍵和0，4鍵斷裂產(chǎn)生RDA裂解。在負(fù)離子模式下，峰41的準(zhǔn)分子離子峰為m/z271.11[M-H]-，二級(jí)質(zhì)譜圖示于圖4c，其母離子的C環(huán)分別發(fā)生1,3和0,4鍵斷裂，形成碎片離子[A1,3]、[A0,4]和[B0,4]，分別為m/z150.87、107.05和177.22。根據(jù)文獻(xiàn)[20]推斷其為柚皮素，屬于二氫黃酮類化合物，可能的裂解途徑示于圖7。

圖6 負(fù)離子模式下，槲皮素可能的質(zhì)譜裂解途徑Fig.6 Fragmentation pathway of quercetin at negative ion mode

圖7 負(fù)離子模式下，柚皮素可能的質(zhì)譜裂解途徑Fig.7 Fragmentation pathway of naringenin at negative ion mode

2.4 鬼箭羽中長(zhǎng)鏈脂肪族成分的UPLC-LTQ-Orbitrap-MS分析

從鬼箭羽中共鑒定得到12種長(zhǎng)鏈脂肪族類化合物，其質(zhì)譜圖一般由一系列的峰簇組成，且峰簇之間相差14 u。

以脂肪族化合物長(zhǎng)鏈脂肪酸為例，長(zhǎng)鏈脂肪族一元羧酸類化合物容易丟失羧基、羥基和水分子，具有γ氫的化合物容易發(fā)生麥?zhǔn)现嘏派尚盘?hào)較強(qiáng)的特征離子m/z(60+14n)，各峰簇之間相差14 u。在負(fù)離子模式下，化合物56的準(zhǔn)分子離子峰為m/z395.07[M-H]-，二級(jí)質(zhì)譜圖示于圖8，其發(fā)生麥?zhǔn)现嘏派伤槠x子m/z340.11；母離子失去羧基生成碎片離子m/z351.02；質(zhì)譜圖中還出現(xiàn)了一系列峰簇組，且峰簇組之間相差14 u，分別為m/z380.10、366.23、352.12。根據(jù)文獻(xiàn)[16]，推斷該化合物為2-丁基二十二烷酸，其可能的裂解途徑示于圖9。

圖8 負(fù)離子模式下，峰56的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.8 MS2 spectrum of peak 56 at negative ion mode

峰59、60具有相同的準(zhǔn)分子離子峰m/z409.16 [M-H]-，其分子式可能為C28H38O或C30H50。峰59的碎片離子有m/z365.28 [M-C2H4-OH]-，表明存在羥基取代基，據(jù)此判斷其為正二十八烷醇。峰60中的碎片離子不存在m/z365.28 [M-C2H4-OH]-，但存在m/z353.04[M-C4H8]-，推斷其為角鯊烯。

2.5 鬼箭羽中三萜類成分的UPLC-LTQ-Orbitrap-MS分析

從鬼箭羽中共鑒定得到7種三萜類化合物，不同母核的三萜類化合物有不同的裂解特征。以峰55為例，在負(fù)離子模式下，準(zhǔn)分子離子峰為m/z469.08 [M-H]-，二級(jí)質(zhì)譜圖示于圖10。母離子先后失去COOH、H2O生成碎片離子m/z407.47，再重排失去C2H6生成碎片離子m/z377.32；或先失去COOH生成碎片離子m/z425.38，再重排失去C2H6生成碎片離子m/z395.41，根據(jù)文獻(xiàn)[21]，推斷該化合物為11-羰基乳香酸，其可能的裂解途徑示于圖11。

圖9 負(fù)離子模式下，2-丁基二十二烷酸的質(zhì)譜裂解途徑Fig.9 Fragmentation pathway of 2-butyl behenate at negative ion mode

圖10 負(fù)離子模式下，峰55的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.10 MS2 spectrum of peak 55 at negative ion mode

2.6 鬼箭羽中其他成分的UPLC-LTQ-Orbitrap-MS分析

對(duì)于一些含量較低的化合物，采用與相關(guān)文獻(xiàn)[12,16]比對(duì)的方法進(jìn)行解析。以峰2為例，在負(fù)離子模式下，其準(zhǔn)分子離子峰為m/z341.03[M-H]-，特征峰為m/z179.02[M-H-C6H10O6]-，將其保留時(shí)間、相對(duì)分子質(zhì)量以及特征峰與文獻(xiàn)[12]中蔗糖的質(zhì)譜信息進(jìn)行對(duì)比，可推斷峰2為蔗糖。

圖11 負(fù)離子模式下，11-羰基乳香酸可能的質(zhì)譜裂解途徑Fig.11 Fragmentation pathway of 11-carbonyl boswellic acid at negative ion mode

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用LC-MS技術(shù)分析鬼箭羽的甲醇提取物，利用Xcalibur 2.1軟件對(duì)質(zhì)譜信息進(jìn)行解析，共分析得到65種不同類型的化合物，其中28種為首次在鬼箭羽中發(fā)現(xiàn)。通過(guò)總結(jié)鬼箭羽中不同類型化合物的裂解方式，建立了已知化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)，可為研究鬼箭羽的化學(xué)成分提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。