RRLC-Q-TOF MS法分析鮮人參與 仙人掌果配伍發(fā)酵前后人參皂苷成分的變化

鄭 飛，張 琰，韓銘鑫，喬夢丹，戴雨霖，越 皓，劉淑瑩

(長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林省人參科學(xué)研究院，吉林 長春 130117)

人參是五加科植物人參(PanaxginsengC.A.Mey.)的干燥根，具有多種藥理活性，廣泛應(yīng)用于藥品、保健品和食品等領(lǐng)域。人參的主要有效成分是人參皂苷，根據(jù)皂苷元母核6位取代基的不同[1-5]，可分為原人參二醇型和原人參三醇型人參皂苷。有研究表明，去糖基化的人參皂苷更易進入血液循環(huán)并發(fā)揮作用，藥理活性和藥用價值優(yōu)于天然含量較高的人參皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rg1、Re[6-7]。

仙人掌果為仙人掌科植物仙人掌的果實，果肉微酸甜，含有多糖類、黃酮類、三萜化合物等物質(zhì)[8-10]。研究表明，仙人掌果具有行氣活血、祛濕退熱、提高免疫力、抗腫瘤、降低血糖血脂血壓、清除自由基等作用[11]。

以人參和仙人掌果為原料，經(jīng)發(fā)酵制得的保健酒仙參果酒，具有提高免疫力、抗疲勞、防治老年性癡呆等保健功能。在酸性和微生物發(fā)酵等條件下，人參皂苷可失去1～5個糖基，轉(zhuǎn)化生成小分子質(zhì)量的稀有人參皂苷，具有更好的生物利用度和藥效活性。

本研究擬采用高分離度快速液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜(RRLC-Q-TOF MS/MS)聯(lián)用技術(shù)分析鮮人參與仙人掌果配伍發(fā)酵過程中的人參皂苷成分，鑒定其中的化合物，并進行定量分析，推測發(fā)酵過程中人參皂苷的轉(zhuǎn)化規(guī)律，希望建立基于生物技術(shù)的人參配伍主要化學(xué)成分分析方法，為質(zhì)量控制提供監(jiān)測數(shù)據(jù)，并為藥品和保健食品開發(fā)提供參考。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

Agilent Zorbax C18色譜柱(2.1 m×150 mm×3.5 μm)；6520 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS(配有電噴霧離子源ESI)，Mass hunter Qualitative AnalysisB.03.01數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)：美國Agilent公司產(chǎn)品。

仙人掌果：海南富匯達農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司產(chǎn)品；人參：購于吉林省撫松縣萬良人參市場；人參皂苷Rh1、Rg2、F2、Rg3、Rh2、CK對照品：純度均不低于98%，南京澤朗醫(yī)藥生物有限公司產(chǎn)品；甲醇、乙腈、甲酸：均為色譜純，美國Tedia公司產(chǎn)品。

1.2 溶液的制備

1.2.1對照品溶液的制備 分別各取約10 mg人參皂苷對照品Rh1、Rg2、F2、Rg3、Rh2、CK于10 mL量瓶中，精密稱定，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成標準品儲備液，備用。不同濃度的對照品溶液由儲備液稀釋制得。

1.2.2鮮人參和仙人掌果發(fā)酵液的制備 按照仙參果酒的制備工藝，將清洗后的鮮人參與仙人掌果分別打漿混合，經(jīng)調(diào)整糖度與pH值，接種發(fā)酵，經(jīng)2次發(fā)酵，過濾后滅菌灌封。

1.2.3樣品溶液的制備 精密量取各10 mL 3批發(fā)酵液，平行測定，于60 ℃水浴揮干后，用10 mL水溶解，再用同體積的飽和正丁醇萃取4次，合并上清液，于60 ℃揮干，用甲醇溶解于10 mL量瓶中，稀釋并定容，搖勻，待測。

1.3 實驗條件

1.3.1色譜條件 色譜柱：Agilent Zorbax Eclipse Plus C18柱(2.1 m×150 mm×3.5 μm)；流動相：A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈；梯度洗脫程序：0～5 min(15%～17%B)，5～10 min(17%～19%B)，10～20 min(19%～21%B)，20～26 min(21%～28%B)，26～37 min(28%～30%B)，37～45 min(30%～36%B)，45～50 min(36%～45%B)，50～58 min(45%～65%B)，58～60 min(65%～80%B)；柱溫35 ℃；流速0.3 mL/min；進樣量5 μL。

1.3.2質(zhì)譜條件 電噴霧負離子掃描模式(ESI-)；干燥氣(N2)流速9 L/min，溫度300 ℃；霧化氣壓力2.41×105Pa；毛細管電壓為3.5 kV；碎裂電壓175 V；錐孔電壓65 V；質(zhì)量掃描范圍m/z100～2 000。

2 結(jié)果與討論

2.1 RRLC-Q-TOF MS化學(xué)成分分析

利用RRLC-Q-TOF MS/MS法對鮮人參與仙人掌果發(fā)酵前后溶液中人參皂苷成分進行比較分析，其總離子流圖示于圖1。RRLC可以較好地分離溶液中皂苷類化合物，高分辨質(zhì)譜和串聯(lián)質(zhì)譜可獲得化合物的分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)信息，在負離子模式一級質(zhì)譜圖中，人參皂苷準分子離子以[M-H]-和[M+HCOO-H]-形式存在。在相同條件下，通過對照品的保留時間、一級質(zhì)譜中分子質(zhì)量信息以及二級串聯(lián)質(zhì)譜圖中碎片離子信息，可以確定皂苷的類型及結(jié)構(gòu)[12]。

圖1 鮮人參與仙人掌果發(fā)酵前(a)與發(fā)酵后(b)人參皂苷總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms of ginsenosides before (a) and after (b) fermentation process

以人參皂苷Rb2為例，闡述人參皂苷的裂解規(guī)律。人參皂苷Rb2為原二醇型人參皂苷，其C-3位取代是2分子葡萄糖側(cè)鏈，C-20位取代為1分子葡萄糖和1分子吡喃型阿拉伯糖側(cè)鏈。在負離子模式下，人參皂苷Rb2主要以準分子離子[M-H]-(m/z1 077.585 1)的形式存在。在一定的碰撞能量下，[M-H]-進一步碎裂，產(chǎn)生相應(yīng)的結(jié)構(gòu)碎片信息。人參皂苷Rb2的二級串聯(lián)質(zhì)譜圖示于圖2。其中，m/z459離子是原人參二醇皂苷元的特征離子，主要碎片離子m/z945.54、783.48、621.43、459.38是m/z1 077通過丟失1分子阿拉伯糖殘基(132 u)和3分子葡萄糖殘基(162 u)產(chǎn)生的，這與文獻[13-15]報道一致。由此推測，該物質(zhì)為人參皂苷Rb2。使用同樣的方法[16]，可以推斷其他人參皂苷的RRLC-MS/MS數(shù)據(jù)，結(jié)果列于表1。

圖2 人參皂苷Rb2的二級質(zhì)譜圖Fig.2 MS/MS spectrum of ginsenoside Rb2

由表1可知，溶液發(fā)酵前檢測到19種人參皂苷，而發(fā)酵后檢測到27種人參皂苷，與發(fā)酵前相比，人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc的含量明顯減少，人參皂苷Rb2、Rd的含量相對增加，同時生成了Rh1、Rg2、Rg4/Rg6、F2、Rk3/Rh4、Rg3、Rh2、CK、Rk1/Rg5等稀有人參皂苷。有研究報道[17-19]，糖苷類化合物由于極性強、分子質(zhì)量較大，口服吸收生物利用度相對較低，難以直接發(fā)揮藥效作用。該類化合物在腸道中被腸道菌群代謝生成次級代謝產(chǎn)物或苷元，這些代謝產(chǎn)物可能是人參在體內(nèi)發(fā)揮藥效作用的活性物質(zhì)。因此，本研究重點對發(fā)酵液中相對含量較高的稀有人參皂苷Rh1、Rg2、F2、Rg3、Rh2、CK進行定量分析。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1線性關(guān)系考察 按1.2.1節(jié)方法制備各對照品儲備液，用甲醇稀釋，配制成系列梯度質(zhì)量濃度的對照品混合溶液。進樣5 μL，記錄峰面積。以峰面積(y)對分析物質(zhì)濃度(x)做線性回歸，繪制標準曲線，得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)，并以3倍信噪比(S/N=3)計算檢測限，10倍信噪比(S/N=10)計算定量限[20]，結(jié)果列于表2。

2.2.2回收率和精密度 精密吸取6份已知含量的供試品溶液，加入近似等量混標含量的對照品溶液進行含量測定。Rh1、Rg2、F2、Rg3、Rh2、CK的回收率分別為98.37%、99.57%、101.12%、100.77%、99.71%、98.80%，RSD分別為1.25%、1.35%、1.11%、1.67%、1.43%、1.25%。結(jié)果表明，該方法的回收率和精密度較好，可以滿足分析要求。

2.3 樣品測定

采用該方法檢測自制的3批發(fā)酵液，采用外標法以峰面積進行定量分析。3批樣品中人參皂苷Rh1、Rg2、F2、Rg3、Rh2、CK的平均含量分別為6.345 2、20.452 2、6.255 9、27.452 8、55.384 6、30.472 9 mg/L。

2.4 轉(zhuǎn)化途徑分析

2.4.1原人參二醇型人參皂苷轉(zhuǎn)化途徑 在發(fā)酵過程中，原二醇型人參皂苷主要有兩種轉(zhuǎn)化途徑，示于圖3。初步推斷，Rb1脫掉C-20位的1分子葡萄糖、Rb2脫掉C-20位的1分子阿拉伯糖、Rb3脫掉C-20位的1分子木糖、Rc脫掉C-20位的1分子阿拉伯糖轉(zhuǎn)化為Rd。第一種轉(zhuǎn)化方式為：Rd脫掉C-20位的1分子葡萄糖轉(zhuǎn)化為Rg3，Rg3進一步脫水轉(zhuǎn)化為Rg5/Rk1；第二種轉(zhuǎn)化方式為：Rd脫掉C-3位的1分子葡萄糖轉(zhuǎn)化為F2，F(xiàn)2脫掉C-3位的1分子葡萄糖直接轉(zhuǎn)化成CK，也可脫掉C-20位的1分子葡萄糖轉(zhuǎn)化為Rh2。

表1 鮮人參與仙人掌果發(fā)酵液中人參皂苷的MS/MS數(shù)據(jù)(n=3)Table 1 MS/MS data of ginsenosides in fermentation process of fresh ginseng and prickly pear (n=3)

注：“-”代表未檢測到；“+”代表峰面積小于106；“++”代表峰面積為(1～5)×106；“+++”代表峰面積為(5～10)×106；“++++”代表峰面積為(1～5)×107

表2 人參皂苷對照品的回歸方程、線性范圍、線性相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限(n=3)Table 2 Regression equations, linear ranges, correlation coefficients (r), limits of detection(LODs) and limits of quantification (LOQs) of ginsenosides (n=3)

2.4.2原人參三醇型人參皂苷轉(zhuǎn)化途徑 在發(fā)酵過程中，原三醇型人參皂苷主要有兩種轉(zhuǎn)化途徑，示于圖4。初步推斷，人參皂苷Re脫掉C-20位的1分子葡萄糖轉(zhuǎn)化為Rg2，Rg2進一步脫水轉(zhuǎn)化為Rg4/Rg6；另一途徑為人參皂苷Re脫掉C-6位的1分子鼠李糖轉(zhuǎn)化為Rg1，Rg1繼續(xù)脫掉C-20位的1分子葡萄糖轉(zhuǎn)化為Rh1，Rh1進一步脫水可轉(zhuǎn)化為Rk3/Rh4。

圖3 發(fā)酵過程中原人參二醇型皂苷的可能轉(zhuǎn)化途徑Fig.3 Possible pathways of protopanaxadiol ginsenosides in fermentation process

圖4 發(fā)酵過程中原人參三醇型皂苷的可能轉(zhuǎn)化途徑Fig.4 Possible pathways of protopanaxatriol ginsenosides in fermentation process

3 結(jié)論

長白山道地藥材人參和熱帶植物仙人掌果配伍，經(jīng)發(fā)酵工藝制得保健酒仙參果酒，不僅降低了人參的燥性，同時轉(zhuǎn)化生成稀有人參皂苷，提高了抗氧化、增強免疫力等活性。本研究對人參與仙人掌果配位發(fā)酵液中的人參皂苷Re、Rb1、Rg1進行測定，同時分析多種人參皂苷含量的變化及轉(zhuǎn)化路徑，經(jīng)RRLC-Q-TOF MS/MS檢測鑒定出27種人參皂苷，其中轉(zhuǎn)化生成了相對含量較高的人參皂苷Rh1、Rg2、F2、Rg3、Rh2、CK，該過程中人參皂苷的轉(zhuǎn)化主要是由仙人掌果為發(fā)酵體系提供了酸性條件和糖。本研究不僅為仙參果酒的功能性提供了物質(zhì)基礎(chǔ)研究，同時還可為相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量標準的制訂提供依據(jù)。