香芹酚對(duì)STZ誘導(dǎo)的1型糖尿病小鼠主動(dòng)脈血管重構(gòu)的影響

劉 蕓，馬凱婷，袁曉悅，侯 寧

(廣州醫(yī)科大學(xué)1. 藥學(xué)院藥理學(xué)教研室、2. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心機(jī)能實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 511436)

糖尿病(diabetes mellitus, DM)是由于免疫功能紊亂、微生物感染、遺傳因素等各種致病因子作用于機(jī)體，導(dǎo)致胰島素功能減退或胰島素抵抗而引起的糖、蛋白質(zhì)、脂肪等一系列的代謝紊亂綜合征，臨床上主要以慢性血糖升高為主要特點(diǎn)。DM分為兩種類型，1型DM也叫胰島素依賴型，是由于胰島B細(xì)胞被破壞，導(dǎo)致胰島素絕對(duì)缺乏。2型DM也叫非胰島素依賴型，由于胰島素功能受損，導(dǎo)致胰島素相對(duì)缺乏。DM已經(jīng)成為全世界發(fā)病率、死亡率最高的5種疾病之一。中國是DM大國，據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國18歲及以上的成年人中DM患者已經(jīng)超過1億，DM血管病變是DM患者主要的慢性并發(fā)癥，也是導(dǎo)致DM患者死亡的主要原因[1]。常見的血管病變分為大血管病變和微血管病變。大血管病變有心血管病變和腦血管病變，容易導(dǎo)致冠心病和腦卒中。微血管病變主要發(fā)生在腎臟、視網(wǎng)膜及皮膚的微血管，容易造成糖尿病性腎病，糖尿病性視網(wǎng)膜病變以及皮膚缺血性潰瘍。DM血管病變主要?dú)w因于內(nèi)皮細(xì)胞以及平滑肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能障礙。因此，深入研究并闡明內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞功能受損參與DM血管并發(fā)癥的分子機(jī)制，并在此基礎(chǔ)上尋找干預(yù)靶點(diǎn)，對(duì)防治DM及其血管并發(fā)癥具有重要意義。

香芹酚(carvacrol，CAR)普遍存在于許多芳香植物的揮發(fā)油中，如牛至、百香果、冬季香薄荷、亞加菌等。CAR具有分子小、脂溶性高、易通過細(xì)胞膜等特點(diǎn)，同時(shí)對(duì)人體無毒，因而在日常生活中得到了廣泛應(yīng)用，經(jīng)常作為香料添加劑在食品中使用。目前的研究證實(shí)，CAR具有抗炎[2]、抗氧化[3]、抗腫瘤[4]、抗菌[5]等生物活性。進(jìn)一步的研究報(bào)道，CAR能促進(jìn)大鼠離體胸主動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性的血管舒張[6]。Suntres等[7]報(bào)道，在腦動(dòng)脈分離的內(nèi)皮細(xì)胞中，CAR通過激活TRPV3通道，使內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞發(fā)生超極化，導(dǎo)致血管舒張。以上研究提示CAR具有血管保護(hù)作用，但CAR對(duì)1型DM小鼠主動(dòng)脈血管重構(gòu)的影響目前尚不清楚。因此，本研究以C57BL/6小鼠為主要研究對(duì)象，通過腹腔注射鏈脲霉素(streptozocin，STZ)建立1型DM模型，探討CAR對(duì)DM小鼠主動(dòng)脈血管重構(gòu)的影響。

1 材料

1.1藥物與試劑CAR購自美國Aldrich公司；STZ購自美國Sigma公司；p-Akt、Akt、p-PDK1、PDK1、α-actin、Ki67抗體，均購自美國Cell Signal Technology公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)C57BL/6小鼠，7～8周齡，♂，體質(zhì)量(22.0±3.0)g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證：SCK(粵)2013-0002。飼養(yǎng)環(huán)境模擬自然晝夜條件，濕度45%～50%，溫度(22±3)℃，自由飲水。

1.3儀器低溫高速離心機(jī)(美國Eppendorf公司)；穩(wěn)豪型血糖儀及血糖試紙(美國強(qiáng)生公司)；多功能酶標(biāo)儀(美國Beckman公司)；自動(dòng)洗片機(jī)(美國Kodak公司)。

2 方法

2.1DM模型的制備與分組DM模型組小鼠腹腔注射0.2% STZ(45 mg·kg-1·d-1)，連續(xù)注射5 d。對(duì)照組給予相應(yīng)劑量的檸檬酸緩沖液。注射結(jié)束后3 d，檢測小鼠血糖，將血糖濃度高于16.7 mmol·L-1的小鼠視為DM模型誘導(dǎo)成功。DM模型誘導(dǎo)成功后第4周，檢測小鼠血糖持續(xù)、穩(wěn)定升高，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)分組：① 對(duì)照組(Con)；② DM組；③ CAR低劑量組(DM+CAR 10 mg·kg-1)；④ CAR高劑量組(DM+CAR 20 mg·kg-1)。每天腹腔注射CAR 1次，連續(xù)給藥6周。每周測量小鼠體質(zhì)量和隨機(jī)血糖。給藥6周后處死小鼠，取出胸主動(dòng)脈。

2.2HE染色主動(dòng)脈固定在4%的多聚甲醛中，48 h內(nèi)進(jìn)行石蠟包埋，用蘇木精和伊紅染色，然后在光學(xué)顯微鏡下分析。

2.3Westernblot檢測主動(dòng)脈裂解后，離心后取上清，BCA法蛋白定量，并制成蛋白樣品。經(jīng)SDS-PAGE分離蛋白，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫振蕩封閉1 h。用BSA/TBS稀釋的一抗4℃孵育過夜。TBST洗滌5 min，反復(fù)3次，二抗室溫孵育1 h，TBST漂洗10 min，反復(fù)3次。加入 ECL 顯色液，暗室內(nèi)X線片曝光。Image J軟件分析條帶。

2.4免疫組化檢測石蠟切片脫蠟至水，然后進(jìn)行抗原修復(fù)，接著用3% BSA封閉30 min，在切片上滴加一抗4℃孵育過夜，d 2滴加二抗，然后用DAB顯色，復(fù)染細(xì)胞核，脫水封片，顯微鏡拍照采集圖像。

3 結(jié)果

3.1CAR對(duì)1型DM小鼠隨機(jī)血糖的影響如Fig 1所示，與正常小鼠相比，DM小鼠的隨機(jī)血糖明顯升高；與DM小鼠相比，CAR給藥組小鼠的隨機(jī)血糖降低(P<0.05)，且CAR低劑量組小鼠的隨機(jī)血糖與高劑量組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明CAR可以明顯降低1型DM小鼠的血糖。

Fig 1 Changes of mice random blood glucose during

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsDM

3.2CAR對(duì)1型DM小鼠主動(dòng)脈血管形態(tài)的影響Fig 2的HE結(jié)果顯示，DM組與正常組相比，主動(dòng)脈血管壁變薄，細(xì)胞數(shù)量減少。低、高劑量CAR組可明顯改善DM小鼠主動(dòng)脈血管重構(gòu)，增加血管壁厚度。說明CAR可以明顯改善DM小鼠主動(dòng)脈血管重構(gòu)。

Fig 2 Morphological characteristics of aorta by HE staining

3.3CAR對(duì)1型DM小鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞表型的影響為了研究CAR改善血管重構(gòu)的機(jī)制，分別用Western blot和免疫組化檢測了主動(dòng)脈α-actin和Ki67的表達(dá)。Fig 3A的Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，DM組α-actin表達(dá)明顯增加(P<0.05)，低、高劑量CAR組可抑制DM誘導(dǎo)的α-actin表達(dá)增加(P<0.05)。Fig 3B的免疫組化結(jié)果顯示，DM組相比對(duì)照組Ki67表達(dá)降低(P<0.05)，而低、高劑量CAR組可明顯逆轉(zhuǎn)DM誘導(dǎo)的Ki67表達(dá)降低(P<0.05)。

3.4CAR對(duì)PDK1、Akt蛋白表達(dá)水平的影響為了研究CAR是否通過PI3K/Akt通路，改善主動(dòng)脈血管重構(gòu)，我們檢測了PDK1和Akt的表達(dá)水平。Fig 4的Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，DM組主動(dòng)脈PDK1和Akt的磷酸化水平明顯降低(P<0.05)，低、高劑量CAR組可明顯抑制DM誘導(dǎo)的PDK1和Akt磷酸化水平的降低(P<0.05)。

4 討論

DM是嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病之一，心血管疾病是DM的重要并發(fā)癥，每年DM患者死于心血管疾病的比例占總死亡人數(shù)的50%～80%[8]。因此，DM誘發(fā)的心血管疾病是導(dǎo)致DM患者死亡的主要原因，研究DM心血管病變的分子機(jī)制具有十分重要的意義。

CAR又名香荊芥酚，具有麝香草酚類的氣味，存在于各類天然植物、果實(shí)及植物揮發(fā)油中，是牛至屬植物油的主要成分。在日常生活中，CAR常用于配制消毒劑、殺菌劑、香料、食品添加劑及防腐劑等。近年來，CAR在DM及其并發(fā)癥中的作用得到了研究者們的日益關(guān)注。有研究發(fā)現(xiàn)，在DM早期口服CAR可以輕度降低DM大鼠血糖，明顯降低總膽固醇、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶和乳酸脫氫酶[9]。Deng等[10]發(fā)現(xiàn)，CAR通過抗氧化、抑制炎癥等效應(yīng)，改善DM大鼠認(rèn)知功能障礙，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有保護(hù)作用。項(xiàng)目組前期研究通過腹腔注射STZ建立1型DM小鼠模型，連續(xù)6周給予小鼠CAR(10、20 mg·kg-1)腹腔注射，發(fā)現(xiàn)CAR長期使用具有良好的降血糖效果。此外，CAR還可以輕度降低DM小鼠甘油三酯水平，改善DM小鼠脂質(zhì)代謝紊亂[11]。但CAR對(duì)DM誘發(fā)的心血管并發(fā)癥是否具有保護(hù)作用，及其機(jī)制目前尚不清楚，亟待深入研究。因此，在前期研究基礎(chǔ)上，本課題通過腹腔注射低、高劑量CAR，檢測DM小鼠的主動(dòng)脈血管形態(tài)及功能，評(píng)價(jià)CAR對(duì)1型DM小鼠血管重構(gòu)的影響，并初步探討其機(jī)制。

Fig 3 Effects of CAR on expression of α-actin and Ki67 in aorta by Western blot

Fig 4 Effects of CAR on phosphorylation of PDK1 and Akt in aorta by Western blot n=5)

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsDM

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，長期連續(xù)給予1型DM小鼠CAR(10、20 mg·kg-1)，其隨機(jī)血糖明顯降低，高劑量與低劑量組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HE結(jié)果顯示，DM組主動(dòng)脈血管壁變薄，細(xì)胞丟失。給予低、高劑量的CAR后，DM小鼠主動(dòng)脈血管壁厚度都基本恢復(fù)至正常水平。DM血管病變可主要?dú)w因于內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能失調(diào)。其中，血管平滑肌細(xì)胞主要分布于動(dòng)脈中膜，生理狀態(tài)下表現(xiàn)為收縮型，用于維持動(dòng)脈收縮和舒張功能。在一些病理因素刺激下，細(xì)胞因子以自分泌或旁分泌的方式，促進(jìn)血管平滑肌表型由收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚?，從而促進(jìn)血管平滑肌的增殖。研究表明，高糖通過激活Rho/蛋白激酶C通路，促進(jìn)肌動(dòng)蛋白聚合，誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞收縮功能增加[12]。Schmidt等[13]也證明，在1型DM模型中，Toll樣受體2通過激活RhoA通路，促進(jìn)血管平滑肌收縮型標(biāo)志基因肌球蛋白輕鏈、肌球蛋白磷酸酶亞單位Ⅰ的表達(dá)，從而增強(qiáng)血管的收縮功能。因此，在本實(shí)驗(yàn)中，我們檢測了收縮型標(biāo)志基因α-actin和合成型標(biāo)志基因Ki67的表達(dá)。結(jié)果顯示，DM組α-actin表達(dá)增加，Ki67表達(dá)降低，低、高劑量CAR明顯降低DM組α-actin的表達(dá)，增加Ki67的表達(dá)。說明CAR能通過改變平滑肌細(xì)胞表型，改善1型DM持續(xù)高糖誘導(dǎo)的血管重構(gòu)。

PI3K/Akt通路在細(xì)胞代謝、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡、胰島素抵抗等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用[14]。PDK1、Akt作為該通路的兩個(gè)關(guān)鍵激酶，其磷酸化狀態(tài)代表該通路的活化狀態(tài)。Hamamdzic等[15]的研究表明，在DM聯(lián)合高脂飲食誘導(dǎo)的豬模型中，Akt及其下游糖原合成酶激酶-3β的磷酸化被明顯抑制，導(dǎo)致細(xì)胞增殖與凋亡失衡，從而加劇動(dòng)脈粥樣硬化。我們的研究結(jié)果與前期文獻(xiàn)報(bào)道一致，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DM組PDK1及Akt的磷酸化水平受到抑制，給予低、高劑量的CAR后，Akt的磷酸化水平有所恢復(fù)，且PDK1的磷酸化水平基本恢復(fù)正常。說明CAR可能通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt通路，抑制血管平滑肌的收縮功能，改善DM血管重構(gòu)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CAR可降低1型DM小鼠血糖，改善主動(dòng)脈血管重構(gòu)，對(duì)DM及并發(fā)的血管疾病有一定的治療作用。今后的工作中，我們將進(jìn)一步在細(xì)胞水平明確CAR對(duì)血管重構(gòu)的影響及其分子機(jī)制，為確定DM并發(fā)的血管疾病治療的新靶點(diǎn)提供初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。