18F-FLT micro PET/CT顯像評(píng)估馬藺子素對(duì)裸鼠乳腺癌的放射增敏作用

譙 鳳，徐慧琴，汪 會(huì)，余文靜，張 丹，蘇曉雨

(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，安徽 合肥 230022)

惡性腫瘤嚴(yán)重著威脅人類健康，如何提高腫瘤治療效果及生存預(yù)后，是近幾十年來國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)。對(duì)于中晚期惡性腫瘤，放射治療是主要治療方法之一，然而，實(shí)體瘤中乏氧組織的存在，嚴(yán)重影響放射治療效果。研究表明，腫瘤放療增敏劑是解決腫瘤內(nèi)乏氧細(xì)胞對(duì)治療抗拒性的有效途徑之一[1]。我國(guó)自主研發(fā)的放射增敏劑馬藺子素(irisquinone，IR)是從中草藥馬藺子中提取的一種醌類化合物，對(duì)放射治療有明顯的增敏作用[2]。PET/CT能夠監(jiān)測(cè)腫瘤內(nèi)環(huán)境，通過不同顯像劑更加全面準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)腫瘤治療反應(yīng)。隨著核醫(yī)學(xué)顯像設(shè)備的發(fā)展，micro PET/CT能夠無創(chuàng)、動(dòng)態(tài)、定量地從分子水平觀察藥物在小動(dòng)物體內(nèi)的吸收、分布、代謝、排泄等過程。3’-脫氧-3’-18F-氟胸苷(3’-deoxy-3’-18F-fluorothymidine,18F-FLT)作為新近開發(fā)的增殖顯像劑，可反映腫瘤增殖狀況，評(píng)價(jià)腫瘤放、化療療效[3]。本實(shí)驗(yàn)擬通過建立裸鼠MDA-MB231乳腺癌模型，并對(duì)其用IR進(jìn)行放射增敏治療，探討18F-FLT micro PET/CT顯像評(píng)估放射增敏療效的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株與試劑MDA-MB231乳腺癌細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰酶，均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；IR(批號(hào)：1601255)購(gòu)自山東新華制藥公司；Ki-67抗體購(gòu)自武漢三鷹生物科技有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物32只BALB/c裸鼠，♀，4～6周齡，體質(zhì)量(20±2)g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)：SCXK(滬2012-0002)。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)及腫瘤接種MDA-MB231乳腺癌細(xì)胞采用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，于5% CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱(MCO-15AC型，日本SANYO公司)中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼滿瓶底約80%時(shí)，用含EDTA的胰酶消化制成單細(xì)胞懸液(2×1010·L-1)，取0.2 mL皮下接種于裸鼠右上肢腋下，待瘤體最大直徑≥1 cm時(shí)進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

1.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組皮下接種成瘤率100%，將制備成功的32只裸鼠乳腺癌模型隨機(jī)分為對(duì)照組、IR組、單純放療組、IR+放療組，每組8只。IR組：放療前7 d開始每日給予IR蒸餾水懸濁液灌服，劑量約為每只0.5 mg；對(duì)照組：給予蒸餾水灌服；單純放療組：每只裸鼠用0.5%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，放療采用美國(guó)Varian23EX醫(yī)用直線加速器，使用6 MeV電子線照射，單次放療，照射野10 cm×10 cm，劑量為10 Gy；IR+放療組：IR的灌服同IR組，放療方法及劑量同單純放療組。

1.518F-FLTmicroPET/CT顯像采用德國(guó)Siemens公司Inveon micro PET/CT進(jìn)行掃描顯像；FLT前體購(gòu)自常熟華益化工有限公司，18F-FLT由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院PET中心生產(chǎn)，放化純>95%。所有MDA-MB231乳腺癌裸鼠模型均于放療前及放療結(jié)束后24 h，行micro PET/CT顯像。裸鼠于顯像前夜禁食，可自由飲水。將裸鼠固定，于裸鼠尾靜脈注射18F-FLT約5.55 MBq(150 μCi)，1 h后，用異氟烷麻醉并俯臥位固定于掃描床上進(jìn)行顯像，CT掃描10 min，PET掃描5 min，然后圖像融合。顯像完成后，由2位高年資的核醫(yī)學(xué)科醫(yī)師對(duì)micro PET/CT圖像進(jìn)行分析，選擇病灶放射性濃聚最高的層面，測(cè)量SUV最大值(SUVmax)。

1.6免疫組化檢測(cè)顯像完成后，采取頸椎脫臼法處死裸鼠。取出腫瘤組織，用體積分?jǐn)?shù)10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，4 μm厚切片，行Ki-67免疫組化檢查。Ki-67蛋白以細(xì)胞核呈棕黃色或細(xì)胞質(zhì)同時(shí)呈棕黃色為陽(yáng)性。在高倍鏡下，隨機(jī)選擇5個(gè)視野拍照分析，計(jì)算每張照片陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比(陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))。

2 結(jié)果

2.118F-FLTmicroPET顯像結(jié)果 32只裸鼠micro PET/CT顯像右側(cè)腋下均可見結(jié)節(jié)狀不同程度放射性攝取增高灶，部分腫瘤內(nèi)部可見片狀放射性分布缺損區(qū)。放療前，4組顯像SUVmax比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.017，P>0.05)；放療后，4組之間SUVmax差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=123.145，P<0.05)，對(duì)照組及IR組顯像SUVmax較放療前明顯升高(t=-11.339、-11.103，P<0.05)，單純放療組及IR+放療組SUVmax較放療前明顯降低(t=13.516、22.753，P<0.05)，且IR+放療組SUVmax較單純放療組下降更明顯(t=7.065，P<0.05)。見Tab 1、Fig 1。

Tab 1 The SUVmax of tumor in all groups before and

*P<0.05vsbefore radiotherapy;#P<0.05vs24h after radiotherapy

Fig 1 18F-FLT micro PET/CT imaging of MDA-MB231 breast cancer in nude mice 24 h after radiotherapy

A: Control group; B: IR group; C: Radiotherapy group; D: IR+radiotherapy group. The red arrowhead refers to the tumor.

2.2免疫組化結(jié)果如Fig 2所示，對(duì)照組、IR組、單純放療組、IR+放療組陽(yáng)性細(xì)胞百分比分別為(46.43±3.69)%、(45.76±5.75)%、(28.13±4.74)%、(13.04±2.76)%，單純放療組及IR+放療組陽(yáng)性細(xì)胞百分比明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，IR+放療組較單純放療組陽(yáng)性細(xì)胞百分比更低(P<0.05)。

Fig 2 The Ki-67 immunohistochemistry in all groups of MDA-MB231 breast cancer in nude mice(×400)

A: Control group; B: IR group; C: Radiotherapy group; D: IR+radiotherapy group; E: The percentage of Ki-67 positive cells.#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsradiotherapy group.

2.3SUVmax與Ki-67表達(dá)的相關(guān)性分析Fig 3的Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，Ki-67表達(dá)與SUVmax呈明顯正相關(guān)(r=0.897，P<0.05)。

Fig 3 Correlation between expression of Ki-67 and SUVmax

3 討論

腫瘤的早期療效評(píng)價(jià)直接影響腫瘤的后續(xù)治療，關(guān)系著患者的生存及預(yù)后，應(yīng)用合適的療效評(píng)估方法可以給臨床提供很大的幫助。相比傳統(tǒng)的CT、MRI檢查，正電子發(fā)射型計(jì)算機(jī)體層成像(PET/CT)對(duì)于腫瘤的診斷、分期及療效評(píng)估有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[4]。那些通過對(duì)實(shí)體瘤大小變化來判斷治療效果的傳統(tǒng)方法，難以對(duì)腫瘤早期療效進(jìn)行準(zhǔn)確評(píng)估，而PET/CT顯像結(jié)合了PET功能成像與CT解剖成像的各自優(yōu)點(diǎn)，既能準(zhǔn)確定位，又能在實(shí)體瘤大小變化之前，更早、更準(zhǔn)確地從功能上評(píng)估腫瘤的放療增敏療效[5-6]。惡性腫瘤的一大生物學(xué)特點(diǎn)是生長(zhǎng)快，腫瘤細(xì)胞增殖迅速，因此，可通過檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖活性，評(píng)價(jià)腫瘤治療效果[7]。18F-FLT是一種胸腺嘧啶類似物，為新近開發(fā)的細(xì)胞增殖顯像劑，能夠在胸腺嘧啶核苷激酶1(thymidine kinase 1，TK1)的作用下磷酸化，生成FLT-磷酸鹽，滯留在細(xì)胞內(nèi)。TK1是細(xì)胞DNA補(bǔ)救合成過程中的關(guān)鍵酶，在增殖細(xì)胞的S期和G1期有活性，而在靜止細(xì)胞中無活性，因此，18F-FLT可以間接反映腫瘤增殖狀況，評(píng)價(jià)腫瘤放、化療療效[8]。放射治療通過電離輻射破壞腫瘤細(xì)胞DNA，使細(xì)胞壞死達(dá)到治療目的，腫瘤對(duì)射線的敏感性是放射治療是否有效的關(guān)鍵[9]。大多數(shù)實(shí)體瘤中存在的乏氧細(xì)胞使得其對(duì)射線不敏感，對(duì)于這種情況，使用放射增敏劑可以抑制腫瘤內(nèi)乏氧細(xì)胞對(duì)射線的抗拒作用，提高放射敏感性，從而增加治療效果[1]。IR是我國(guó)自主研發(fā)的一種放射增敏劑，它通過增加乏氧細(xì)胞DNA單鍵斷裂，抑制惡性腫瘤細(xì)胞DNA合成及斷裂后的修復(fù)，增加對(duì)放射治療的敏感性[2]。Ki-67是一種細(xì)胞核增殖抗原，表達(dá)于細(xì)胞周期的S、G1、G2、M期, 而在G0期不表達(dá)[10]。Ki-67的表達(dá)與細(xì)胞增殖活性及預(yù)后密切相關(guān)，Ki-67表達(dá)高預(yù)示著細(xì)胞增殖活性高，因此，其可反映細(xì)胞增殖狀態(tài)，同時(shí)Ki-67也可作為一種評(píng)估腫瘤治療及預(yù)后判斷的指標(biāo)[11-12]。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)乳腺癌實(shí)體瘤行放射治療，使用放射增敏劑IR，并用18F-FLT micro PET/CT顯像評(píng)估放射治療療效。結(jié)果顯示，單純放療組及IR+放療組SUVmax均較放療前明顯下降，說明在放射治療后，腫瘤細(xì)胞DNA被破壞，腫瘤增殖受到抑制，滯留在細(xì)胞內(nèi)的18F-FLT減少，因此，在micro PET/CT顯像中，腫瘤病灶的放射性攝取下降。IR+放療組較單純放療組SUVmax下降更明顯，表明使用IR增加了對(duì)乳腺癌放射治療的效果。免疫組化結(jié)果顯示，單純放療組與IR+放療組Ki-67的表達(dá)明顯低于對(duì)照組，IR+放療組表達(dá)更低，說明放射治療后，腫瘤細(xì)胞的增殖活性降低，而使用放射增敏劑的IR+放療組對(duì)放射治療更敏感。18F-FLT micro PET/CT顯像SUVmax與Ki-67表達(dá)呈正相關(guān)，進(jìn)一步驗(yàn)證了18F-FLT micro PET/CT顯像能反映腫瘤治療早期細(xì)胞增殖活性的變化。

綜上所述，IR對(duì)裸鼠乳腺癌具有放射增敏作用，18F-FLT micro PET/CT顯像可以通過反映腫瘤細(xì)胞增殖活性的變化，評(píng)估IR對(duì)乳腺癌的放射增敏作用。