利用納米金法評價(jià)百合總黃酮的抗氧化性

杜 娟， 羅 立， 黃 潔， 羅秋水

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院/南昌市農(nóng)產(chǎn)品加工及質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌 330045

金納米粒子因其獨(dú)特的物理化學(xué)性能而在近年來得到了廣泛關(guān)注，在各領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用。合成金納米粒子的方法有許多，金種子法是其中的一種。該方法以硼氫化鈉為還原劑還原氯金酸制備金種子，而后加入適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)劑阻止其聚集形成大顆粒，形成金納米粒子[1]。近年來，眾多報(bào)道表明植物提取液可作為保護(hù)劑用于金納米粒子的合成，其中起主要作用的為黃酮類化合物[2]。

黃酮類化合物是一類重要的天然有機(jī)化合物，是植物在長期自然選擇過程中產(chǎn)生的一類次生代謝產(chǎn)物[3]，廣泛存在于高等植物及羊齒類植物的根、莖、葉、花、果實(shí)等中，不僅數(shù)量繁多，而且結(jié)構(gòu)類型復(fù)雜多樣。黃酮類化合物具有多種生理功能，主要有抗氧化功能、抗心率失常功能、抗腫瘤抗癌功能、鎮(zhèn)咳祛痰平喘功能、抗炎功能、抗菌抗病毒功能、類激素樣功能及免疫調(diào)節(jié)功能等[4-5]。其中抗氧化功能是目前的研究重點(diǎn)，目前檢測抗氧化性的方法多為1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)法、2 ,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)法等。

香水百合花色艷麗，芳香宜人，是單子葉植物亞綱百合科(Liliaceae)百合屬(Lilium)植物，常用于觀賞。目前，對其研究多集中于組織培養(yǎng)和栽培栽種，對其化學(xué)成分的研究較少。前期試驗(yàn)表明，香水百合中總黃酮化合物的含量較高，且具有一定的抗氧化性[6]。筆者以百合總黃酮提取物為保護(hù)劑還原金種子，建立了利用納米金法評價(jià)百合黃酮抗氧化性的方法。以沒食子酸為對照，比較了香水百合、食用百合、藥用百合3種百合總黃酮化合物抗氧化性的強(qiáng)弱，并與傳統(tǒng)的DPPH法得到的結(jié)果相對比。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 試劑與材料 蕓香苷、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇、沒食子酸、氯金酸、硼氫化鈉、碳酸鉀、濃鹽酸、濃硝酸皆為分析純，DPPH為生化試劑，香水百合、藥用百合、食用百合皆購自當(dāng)?shù)厣痰辍?/p>

1.1.2 儀器 XY-200型高速多功能型粉碎機(jī)；UV-9100紫外可見分光光度計(jì)；DHG-9246A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；BS224S電子天平；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋；SHZ-D(Ⅲ)予華牌循環(huán)水真空泵；移液槍；控溫磁力攪拌器；超聲波清洗器。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 黃酮的提取及含量測定 (1)總黃酮提?。壕_稱取0.5 g干燥后的香水百合、藥用百合、食用百合粉末，以70%乙醇水溶液為提取劑，料液比為1 g ∶30 mL，在50 ℃下水浴提取1.5 h，過濾，提取液以70%乙醇定容至100 mL。(2)總黃酮含量測定：精確稱取205 mg干燥至恒質(zhì)量的蕓香苷粉末，用70%甲醇溶解得蕓香苷儲備液，使用時(shí)用70%甲醇稀釋至0.205 mg/mL，為蕓香苷稀釋液。移取蕓香苷稀釋液0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mL，分別放置于50 mL容量瓶中，加入70%乙醇溶液至總體積為6 mL，再分別加入5%亞硝酸鈉各2.00 mL，振蕩均勻，放置6 min，然后加入10%氯化鋁1.00 mL，振蕩均勻，放置6 min，最后加4%氫氧化鈉20.00 mL，搖勻，用水定容至刻度線，放置15 min，在 510 nm 波長處測定吸光度。以蕓香苷濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。從100 mL各提取液中移取 1.5 mL 總黃酮提取液至50 mL容量瓶中，加70%乙醇溶液至6 mL，按測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法進(jìn)行測定，求得各提取液中黃酮的含量。

1.2.2 納米金法評價(jià)百合總黃酮抗氧化性 (1)金種子的制備。取100 mL經(jīng)4 ℃冷藏的超純水，加入1.5 mL 1%(質(zhì)量濃度)HAuCl4溶液，在持續(xù)攪拌狀態(tài)下加入0.5 mL 0.2 mol/L K2CO3溶液，再加入4.5 mL 0.5 mg/mL NaBH4溶液，持續(xù)攪拌 5 min，即得酒紅色金種子溶液，4 ℃保存。

(2)K2CO3-HAuCl4溶液的制備。稱取50 mg K2CO3固體，加入100 mL超純水，持續(xù)攪拌10 min，再向其中加入 1.5 mL 1%(質(zhì)量濃度) HAuCl4溶液，繼續(xù)攪拌30 min，溶液顏色由淡黃逐漸變成無色透明，即為制備成功，4 ℃保存。

(3)以沒食子酸(GA)為保護(hù)劑的納米金顆粒的生長。取 6 mL K2CO3-HAuCl4溶液于50 mL燒杯中，置于磁力攪拌器上勻速攪拌，加入100 μL金種子溶液，而后迅速加入600 μL超純水，繼續(xù)攪拌10 min，于521 nm處檢測其吸光度，作為空白對照。重復(fù)上述步驟，將600 μL超純水分別替換為濃度為0.2、0.1、0.06、0.02、0.008、0.004 mg/mL的GA溶液，分別測定其對應(yīng)的吸光度。以GA濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(4)以百合總黃酮提取液為保護(hù)劑的納米金顆粒的生長。分別取3種百合黃酮提取液各10 mL，濃縮至1 mL。取6 mL K2CO3-HAuCl4溶液于50 mL燒杯中，置于磁力攪拌器上勻速攪拌，加入100 μL金種子溶液，而后迅速加入600 μL超純水，攪拌20 min后，檢測其在521 nm處的吸光度，作為空白對照。重復(fù)上述步驟，將600 μL超純水分別換成3種不同類型的黃酮提取液，測定相應(yīng)的吸光度，并根據(jù)上一步得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線求得各黃酮提取液對應(yīng)的GA當(dāng)量，每個(gè)樣品平行做2份，取平均值。

1.2.3 DPPH法評價(jià)百合總黃酮抗氧化性[7]將濃度為 2.0×10-4mol/L DPPH乙醇溶液2 mL和各百合黃酮提取液2 mL在試管中混勻，25 ℃下避光反應(yīng)30 min，于517 nm處測定吸光度。用乙醇作空白對照。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)對照，DPPH自由基清除率由下式計(jì)算，每個(gè)樣品平行做2份，取平均值。

(1)

式中：S表示DPPH自由基清除率(%)；Di表示2 mL DDPH溶液和2 mL樣品溶液混合后在517 mm下的吸光度；Dj表示2 mL樣品溶液和2 mL乙醇溶劑混合液在517 mm下的吸光度；D0表示2 mL DDPH溶液和2 mL乙醇溶劑混合液在 517 mm 下的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種百合中的黃酮含量

分光光度法是測定黃酮含量的常用方法。黃酮分子B環(huán)上的3，4-鄰二苯酚羥基可與鋁離子在堿性條件下絡(luò)合，生成棕紅色的金屬絡(luò)合物。以蕓香苷為標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得線性方程為y=0.011x-0.001 1，將各黃酮提取液樣品測得的吸光度代入線性方程，可求得3種百合黃酮提取液的總黃酮平均濃度：香水百合為10.74%、藥用百合為0.92%、食用百合為0.14%。結(jié)果表明，香水百合中總黃酮含量遠(yuǎn)高于藥用百合和食用百合。

2.2 納米金法評價(jià)抗氧化性

沒食子酸或黃酮類化合物具有抗氧化性，加入金種子溶液中可起到保護(hù)劑的作用，阻止納米金粒子的進(jìn)一步聚集，形成具有一定顆粒大小的納米金溶液。在本試驗(yàn)中將不同濃度的沒食子酸溶液加入金種子溶液中，觀察反應(yīng)后的顏色變化，結(jié)果表明，加入沒食子酸之后，溶液呈酒紅色，說明生成了納米金粒子，且隨沒食子酸濃度的增大，溶液的顏色逐漸加深，表明生成的納米金粒子的顆粒也越多。掃描各溶液的紫外光譜，不同溶液的最大吸收峰位于521 nm，為金納米粒子的特征吸收峰，且吸光度隨沒食子酸濃度的增大而增大。從圖1可以看出，在試驗(yàn)所選的濃度范圍內(nèi)(0.004～0.20 mg/mL)，溶液的吸光度與沒食子酸的濃度呈線性關(guān)系，線性方程為y=4.630 4x-0.001 1，r2=0.997。反應(yīng)溶液的透射電子顯微鏡(TEM)結(jié)果見圖2，由TEM圖可見納米金粒子的生成，生成的納米金粒子近似于球形，粒徑約為20 nm。

采用同樣的方法，用3種百合的總黃酮提取液替換沒食子酸，分別進(jìn)行反應(yīng)，并測其吸光度。分別將其吸光度代入至沒食子酸的線性方程中，求得對應(yīng)的X值，即為抗壞血酸當(dāng)量。GA當(dāng)量越大，說明該百合黃酮提取液抗氧化性越強(qiáng)。根據(jù)計(jì)算可求得3種百合黃酮提取液的GA當(dāng)量：香水百合為63.35 μg/mL、藥用百合為11.86 μg/mL、食用百合為 1.38 μg/mL。由GA當(dāng)量可知，香水百合的抗氧化性最強(qiáng)，藥用百合次之，食用百合最弱。

2.3 DPPH法評價(jià)抗氧化性

DPPH自由基是一種以氮為中心的單電子自由基，其結(jié)構(gòu)簡單，性質(zhì)穩(wěn)定。DPPH自由基乙醇溶液為紫色，最大吸收波長位于517 nm。當(dāng)向其中加入自由基清除劑時(shí)，自由基清除劑能提供電子與DPPH自由基中的單電子配對，導(dǎo)致溶液顏色變淺，吸光度減弱。一般以DPPH自由基清除率為50%時(shí)的樣品濃度(EC50)來衡量樣品對DPPH自由基的清除能力，EC50值越小，樣品清除DPPH自由基的能力越強(qiáng)。3種百合黃酮提取液和對照品沒食子酸對DPPH自由基的清除情況見圖3?？梢钥闯觯瑹o論是樣品還是對照品，在選定濃度區(qū)間內(nèi)，對DPPH自由基的清除率與濃度成正比。通過各自的線性方程可以求得各自的EC50：沒食子酸為 2.31 μg/mL， 香水百合為25.31 μg/mL、藥用百合為 38.75 μg/mL、食用百合為

109.95 μg/mL。試驗(yàn)結(jié)果表明，在3種百合總黃酮提取液中，香水百合清除DPPH自由基的能力最強(qiáng)，藥用百合次之，食用百合最小。該結(jié)果與納米金法得到的結(jié)論相一致。

3 結(jié)論

本研究建立了利用納米金顆粒生長評價(jià)3種百合總黃酮抗氧化性的方法。以沒食子酸為對照，香水百合、藥用百合、食用百合3種百合對應(yīng)的沒食子酸當(dāng)量分別為63.35、11.86、1.38 μg/mL。結(jié)果表明，3種百合總黃酮抗氧化性的強(qiáng)弱依次為香水百合>藥用百合>食用百合。在DPPH自由基的清除試驗(yàn)中，3種百合總黃酮提取液對DPPH均有一定的清除作用，其EC50如下：食用百合為109.95 μg/mL、藥用百合為 38.75 μg/mL、香水百合為25.13 μg/mL，清除率由強(qiáng)到弱依次為香水百合>藥用百合>食用百合，試驗(yàn)結(jié)果與納米金法一致。表明與藥用百合和食用百合相比，香水百合總黃酮提取物具有較強(qiáng)的抗氧化性，且納米金法試驗(yàn)結(jié)果與DPPH法一致?？梢娂{米金法可作為評價(jià)黃酮抗氧化性的新方法。